Principio
Il test della coagulasi viene utilizzato per differenziare Staphylococcus aureus (positivo) dallo stafilococco negativo alla coagulasi (CONS). La coagulasi è un enzima prodotto da S. aureus che converte il fibrinogeno (solubile) nel plasma in fibrina (insolubile). Staphylococcus aureus produce due forme di coagulasi, legate e libere.
La coagulasi legata (fattore di aggregazione) è legata alla parete cellulare batterica e reagisce direttamente con il fibrinogeno. Ciò provoca un’alternanza di fibrinogeno in modo che precipiti sulla cellula stafilococcica, causando il raggruppamento delle cellule quando una sospensione batterica viene miscelata con il plasma. Ciò non richiede un fattore di reazione della coagulasi.
La coagulasi libera comporta l’attivazione del fattore di reazione della coagulasi plasmatica (CRP), che è una molecola modificata o derivata da un complesso di coagulasi-CRP. Questo complesso a sua volta reagisce con il fibrinogeno per produrre il coagulo di fibrina.
Il test della coagulasi su vetrino viene eseguito per rilevare la coagulasi legata o il fattore di aggregazione; il test della coagulasi in provetta viene eseguito per rilevare la coagulasi libera.
Test di coagulasi su vetrino
Il test di coagulasi su vetrino rileva il fattore di aggregazione (precedentemente denominato coagulasi legata alle cellule). Il fattore di aggregazione converte direttamente il fibrinogeno in fibrina causando agglutinazione. La sospensione del microrganismo viene fatta su un vetrino e mescolata con una goccia di plasma.
Un test positivo dell’agglutinazione evidenzia la presenza di Staphylococcus aureus ed alcune specie di stafilococco negativo della coagulasi.
I risultati negativi devono essere confermati con il test della coagulasi in provetta.
Procedimento
- Emulsionare una colonia stafilococcica in una goccia d’acqua su un vetrino pulito e privo di grasso con un minimo di diffusione (se l’isolato non forma una sospensione liscia e lattiginosa, non procedere con il test);
- Effettuare sospensioni simili di controllo dei ceppi positivi e negativi per confermare la corretta reattività del plasma;
- Immergere un inoculo dritto fiammato e raffreddato nel plasma non diluito a temperatura ambiente, estrarre e mescolare le tracce aderenti del plasma nella sospensione stafilococcica sul vetrino;
- Leggi come positivo un ammasso grossolano di cocchi visibili ad occhio nudo entro 10 secondi. Leggi come negativo l’assenza di formazione di grumi o qualsiasi reazione che richieda più di 10 secondi per svilupparsi, ma riesamina tutti i ceppi a reazione lenta mediante il test della coagulasi in provetta.
Risultati attesi
- Coagulasi positiva: aggregazione macroscopica in 10 secondi o meno nella goccia di plasma coagulato ed assenza di aggregazione in soluzione salina o goccia d’acqua.
- Coagulasi negativa: nessun raggruppamento in nessuna delle due gocce.
Interpretazione del test di coagulasi su vetrino
Il test della coagulasi su vetrino è il metodo principale utilizzato per identificare S. aureus nei laboratori clinici, ma presenta alcune limitazioni:
- Circa il 15% dei ceppi ordinari di S. aureus e molti altri MRSA danno reazioni negative;
- Poche specie di stafilococchi coagulasi negativi danno reazioni positive.
Nota: tutti i test della coagulasi su vetrino devono essere confermati usando un test della coagulasi in provetta come test definitivo per S. aureus.
Questo video spiega chiaramente il funzionamento del test della coagulasi su vetrino.
Test della coagulasi in provetta
Il test della coagulasi in provetta rileva la stafilocoagulasi che reagisce con il fattore di reazione della coagulasi (CRF, molecola simile alla trombina).
Stafilocoagulasi e CRF si combinano per convertire indirettamente il fibrinogeno in fibrina. Una sospensione dell’organismo viene incubata con plasma a 37 °C. La formazione di coaguli entro 4 ore indica un test positivo (presenza di Staphylococcus aureus). Alcune specie di stafilococco negativo della coagulasi possono essere positive. Inoltre alcune specie possiedono un enzima che può causare la dissoluzione del coagulo dopo un’incubazione prolungata.
Procedimento
- Preparare una diluizione 1 in 6 del plasma in soluzione salina (0,85% NaCl) e posizionare i volumi di 1 ml del plasma diluito in piccole provette;
- Emulsionare diverse colonie isolate dell’organismo di prova in 1 ml di plasma di coniglio diluito per dare una sospensione lattea;
- Incubare la provetta a bagnomaria per 4 ore;
- Esaminare a 1, 2 e 4 ore per la formazione di coaguli inclinando la provetta di 90° (i coaguli possono liquefarsi dopo la loro formazione);
- Lasciare le provette negative a temperatura ambiente durante la notte e riesaminare.
Risultati attesi
Leggere come positivo qualsiasi formazione di coaguli. Spesso il plasma viene convertito in un gel rigido che rimane in posizione quando il tubo viene inclinato o invertito, ma a volte si vedono dei coaguli fluttuare nel fluido.
- Coagulasi positivo: coagulo di qualsiasi dimensione, ad es. Staphylococcus aureus
- Coagulasi negativa: nessun coagulo (il plasma rimane completamente liquido o mostra solo un precipitato flocculante), per esempio Staphylococcus epidermidis.
E’ preferibile il plasma di coniglio, poiché fornisce una migliore coagulazione, è privo di inibitori ed è sicuro. Il plasma umano contiene citrato di sodio come anticoagulante e alcuni citrati che utilizzano batteri come Enterococcus faecalis possono distruggere l’anticoagulante e causare la coagulazione. Se il plasma non è sterile, possono verificarsi risultati falsi positivi o falsi negativi.
Il plasma di coniglio può essere ottenuto centrifugando il sangue a cui è stato aggiunto EDTA allo 0,1% come anticoagulante. In alternativa, può essere ottenuto in forma liofilizzata da un fornitore commerciale e ricostituito dall’aggiunta di acqua.
Il plasma umano può essere ottenuto da una banca del sangue. Deve essere gestito con le precauzioni appropriate per tutti i fluidi del corpo umano.
Conservare il plasma in piccole porzioni a -20 °C e conservare una scorta di plasma in uso a 4 °C portandolo a temperatura ambiente prima dell’uso.
