Test della bile-esculina

Principio

Il test della bile-esculina è ampiamente usato per differenziare gli enterococchi e gli streptococchi di gruppo D non enterococcici, che sono tolleranti alla bile e possono idrolizzare l’esculina in esculetina, dagli streptococchi di gruppo D viridans, che crescono male sulla bile. È un test rapido e di basso costo con buona sensibilità e specificità (> 90%).

Il test della bile-esculina si basa sulla capacità di alcuni batteri, in particolare gli streptococchi del gruppo D e le specie Enterococcus, di idrolizzare l’esculina in presenza di bile (4% di sali biliari o 40% di bile). Molti batteri possono idrolizzare l’esculina, ma pochi possono farlo in presenza di bile.

L’esculina è un derivato cumarinico glicosidico (6-beta-glucoside-7-idrossi-cumarina). Le due frazioni della molecola (glucosio e 7-idrossicumarina) sono collegate tra loro da un legame estere attraverso l’ossigeno. Per questo test, l’esculina è incorporata in un mezzo contenente il 4% di sali biliari.

I batteri positivi alla bile-esculina sono, prima di tutto, in grado di crescere in presenza di sali biliari. L’idrolisi dell’esculina nel mezzo provoca la formazione di glucosio e un composto chiamato esculetina. Quest’ultims, a sua volta, reagisce con gli ioni ferrici (forniti dal citrato ferrico a componente inorganica) per formare un complesso diffusibile nero.

Test dell'idrolisi dell'Esculina — *Figura 1 – Test dell’idrolisi dell’Esculina*

Metodo

Il Bile esculin agar viene preparato nelle piastre agarizzate o nelle provette. I costituenti del mezzo sono: peptone, estratto di manzo, bile, esculina, citrato ferrico e agar. Il mezzo contiene esculina e peptone per l’alimentazione e la bile per inibire i batteri Gram-positivi diversi dagli streptococchi e dagli enterococchi del gruppo D. Il citrato ferrico viene aggiunto come indicatore di colore.

Con un’ansa sterile, toccare due o tre colonie streptococciche morfologicamente simili e inoculare nelle provette, oppure strisciare la superficie di una piastra;
Incubare la provetta inoculata o la piastra a 35-37 °C per 24 ore e quindi osservare i risultati.

Risultati attesi

Un annerimento diffuso di oltre la metà della provetta entro 24-48 ore, indica l’idrolisi dell’esculina. In piastra saranno osservati aloni neri attorno a colonie isolate e qualsiasi annerimento è considerato positivo. Tutti gli streptococchi di gruppo D saranno positivi alla bile-esculina entro 48 ore.

*Figura 2 – Risultati del test della bile-esculina*

Limitazione del test

Alcuni streptococchi viridans (circa il 3%) possono anche idrolizzare l’esculina in presenza di bile;
L’H2S, prodotto da diversi organismi durante il metabolismo, reagisce anche con il ferro producendo un complesso nero che interferisce con l’interpretazione del test di idrolisi dell’esculina;
Se l’inoculo è troppo elevato o la concentrazione della bile è inferiore al 40%, gli streptococchi del gruppo viridans diversi da S. bovis possono dare una reazione positiva sull’agar.