Spettrometria di massa MALDI-TOF

Principio

Il MALDI-TOF (Fig.1), acronimo di “Matrix-Assisted Laser Desorption/Ionization – Time of Flight”, è di gran lunga lo spettrometro di massa maggiormente utilizzato in diagnostica microbiologica clinica. Come tutti gli spettrometri di massa il MALDI-TOF è formato da una componente detta “sorgente” (MALDI), che genera gli analiti (molecole analizzate), e da una componente detta “analizzatore” (TOF), che elabora e confronta i dati prodotti dagli analiti. Per ottenere l’output di spettrometria di massa, sarà necessario un confronto tra i dati ottenuti sperimentalmente e i dati archiviati in banche dati specifiche, così da poter restituire dati di analisi con un grado variabile di affidabilità. Nell’applicazione microbiologica il dato output di questa spettrometria è l’identificazione di specie batteriche e fungine.

*Figura 1 – Rappresentazione grafica dello spettrometro di massa MALDI-TOF (*http://biorender.com).

Metodo

La sorgente della spettrometria di massa con metodologia MALDI prevede tre fasi. In primo luogo, il campione viene miscelato con un materiale adeguato detto “matrice”, successivamente il campione viene applicato su una lastra di metallo capace di contenere solitamente 96 campioni diversi. In secondo luogo, un laser pulsato irradia il campione, innescando l’ablazione e il desorbimento del campione e del materiale della matrice. Infine, le molecole dell’analita vengono ionizzate e di conseguenza protonate o deprotonate all’interno di gas caldi ablati, e quindi possono essere accelerate in qualsiasi analizzatore, quindi spettrometro di massa, utilizzato.

*Figura 2 – Rappresentazione grafica della piastra di analisi da 96 pozzetti per il biotipizzatore MALDI-TOF (*http://biorender.com).

In microbiologia clinica gli spettri risultanti del MALDI-TOF sono utilizzati per l’identificazione di microrganismi (principalmente batteri o funghi) mediante riconoscimento comparato in banche dati. Una porzione di una colonia del microrganismo analita, precedente seminato su terreno di coltura agarrizzato, viene posizionata sulla piastra (Fig. 2) e ricoperta di matrice. Gli spettri di massa delle proteine espresse generate vengono analizzati da un software dedicato e confrontati con i profili memorizzati per la determinazione delle specie. Tale processo prende il nome di biotipizzazione microbica. Questa metodologia di identificazione microbica offre vantaggi rispetto ad altre procedure immunologiche o biochimiche ed è diventato un metodo comune di diagnostica nei laboratori microbiologici clinici.

Risultati attesi

Il risultato in output di un biotipizzatore MALDI-TOF, è uno spettro (come quelli in Fig. 3) relativo all’intensità rilevata (proporzionale al tempo di volo degli analiti) per unità del rapporto m/z , ovvero del rapporto di massa fratto carica delle proteine (sotto forma di ioni) analizzate. La differenziale composizione proteica dei diversi microrganismi permette la produzione di “cluster spettrali” associati e immagazzinati in un database. Lo spettro prodotto perciò verrà direttamente associato ad un microrganismo con un livello di affidabilità variabile. L’accuratezza percentuale della maggior parte delle strumentazioni MALDI-TOF oscilla tra il 98 e il 99% , rendendolo un gold standard in diagnostica microbiologica clinica.

Figura 3 – Spettri di massa MALDI-TOF di Stenotrophomonas maltophilia (A), Delftia acidovorans (B), Staphylococcus aureus (C), Staphylococcus epidermidis (D), Neisseria meningitidis (E), Neisseria gonorrhoeae (F).

Limitazioni del test

Per gli organismi comunemente incontrati in un laboratorio clinico, la spettrometria di massa MALDI-TOF può identificare accuratamente le specie più strettamente correlate. Tuttavia, ci sono alcune eccezioni. L’incapacità di discriminare tra specie imparentate può essere dovuta alla somiglianza intrinseca degli organismi stessi. Ad esempio, il MALDI-TOF attualmente non è in grado di differenziare E. coli da Shigella. Ciò è probabilmente dovuto al fatto che queste potrebbero non essere due specie, ma in realtà una, come è stato suggerito dai tassonomi. Nonostante ciò, alcuni hanno suggerito che potrebbe essere possibile differenziare questi organismi mediante MALDI-TOF. Un altro motivo per cui specie simili possono essere identificate in modo errato è la mancanza di spettri sufficienti nel database. In questi casi, è possibile ottenere un’identificazione a livello di specie errata o nessuna identificazione. Ad esempio, uno studio ha rilevato che un’identificazione errata era comune per specie simili di Trichophyton (Rychert et al., 2018). Inoltre, può verificarsi un’identificazione errata quando alcuni membri di un complesso di specie sono nel database, ma altri no.

Controlli di qualità

I laboratori devono eseguire il controllo qualità interno prima di utilizzare MALDI-TOF per identificare i microrganismi. Il controllo qualità interno consiste in una calibrazione automatica dello strumento utilizzando uno standard di calibrazione specificato dal produttore. A seconda del sistema, i calibratori includono un estratto prodotto di E. coli o uno specifico ceppo di calibrazione di E. coli. I laboratori dovrebbero assicurarsi di seguire le specifiche dei produttori per la preparazione, l’utilizzo e la conservazione dei calibratori.

I laboratori dovrebbero eseguire inoltre il controllo qualità esterno utilizzando appropriati controlli positivi e negativi. Sebbene la maggior parte dei produttori non lo faccia, la CAP (College of American Pathologists) richiede che i controlli positivi (un microrganismo di controllo appropriato o un calibratore) siano eseguiti nella routine ogni giorno in cui si eseguono test sui pazienti.