Simmons Citrate Agar

Utilizzo

Il Simmons Citrate Agar (Fig.1) è un terreno di coltura per il differenziamento delle Enterobacteriaceae, basato sulla capacità microbica di utilizzare il citrato come sola fonte di carbonio.
Negli anni ’20 del secolo scorso Koser sviluppò un brodo per lo sviluppo e il differenziamento dei coliformi fecali, quest’ultimo fu trasformato da Simmons in un terreno solido di più facile utilizzo ed interpretazione.

Simmons citrate agar con viraggio di colore centrale
Figura 1 – Simmons citrate agar con viraggio di colore centrale [Fonte: scharlab.com]

L’ammonio diidrogeno fosfato rappresenta la fonte di azoto, il fosfato dipotassico funge da tampone, il cloruro di sodio mantiene l’equilibrio osmotico del mezzo; inoltre, come detto in precedenza, il citrato è l’unica fonte di carbonio del terreno. Se questo viene consumato, i batteri libereranno prodotti di scarto fortemente alcalini/basici. Questi ultimi esprimono un enzima chiamato citrato permeasi che converte il citrato in piruvato, successivamente sfruttato per ottenere energia nel ciclo di Krebs.
Nel fare questo, i batteri degradano i sali d’ammonio e liberano ammoniaca che incrementa il carattere alcalino del terreno. Questo innalzamento di pH induce un viraggio dell’indicatore blu di bromotimolo che fa virare il terreno dal verde al blu.

Composizione e preparazione

La composizione del Simmons Citrate Agar è riportata in Tabella 1:

IngredientiQuantità (g/l)
Magnesio solfato0,200
Diidrogeno fosfato d’ammonio1,000
Fosfato dipotassico1,000
Citrato di sodio2,000
Cloruro di sodio5,000
Blu di bromotimolo0,080
Agar15,000
Tabella 1 – Composizione del terreno di coltura [Fonte: Scheda tecnica HIMEDIA]

La formula del terreno può essere adattata a seconda delle esigenze, purché il pH finale del mezzo resti di 6,8. Per la preparazione è necessario seguire determinati passaggi:

  • Sospendere i 24,28 g di polvere in 1 l di acqua pura/distillata.
  • Portare ad ebollizione e mescolare fino al completo scioglimento delle polveri.
  • Trasferire il liquido in piastre o in fiasche.
  • Sterilizzare tramite un ciclo in autoclave a 121°C per 15 minuti.

Prima di iniziare è necessario assicurarsi che il pH dell’acqua sia compreso tra 6,5 e 7. Se così non fosse, infatti, il colore del mezzo potrebbe essere decisamente diverso da quanto atteso.

Metodo

La procedura di laboratorio prevede di ottenere colture pure dell’organismo che si intende testare, e successivamente il campione potrà essere seminato sulla piastra che dovrà essere incubata a 37°C per 24-48 h.

Risultati della crescita

I coliformi fecali sono incapaci di utilizzare il citrato ed i sali d’ammonio come uniche fonti di carbonio e di azoto presenti nel mezzo. Al contrario, alcuni coliformi non fecali come Enterobacter aerogenes sono in grado di svilupparsi e accrescersi in presenza del solo citrato, facendo virare il pH verso il basico e il colore del terreno dal verde al blu.
Soltanto i microrganismi capaci di servirsi del citrato cresceranno su questo terreno vigorosamente: per esempio, Escherichia coli non si sviluppa sul mezzo o, se lo fa, la crescita risulta talmente minima da non determinarne particolari cambiamenti di colore.

I risultati ottenibili sono riassunti in Tabella 2:

MicrorganismoTipologia inoculoSviluppoAspetto
Citrobacter freundii ATCC 43864DirettoCrescita buonaBlu
Enterobacter aerogenes ATCC 13048DirettoCrescita buonaBlu
Escherichia coli ATCC 25922DirettoInibizione totale o parzialeVerde
Proteus mirabilis ATCC 29906DirettoCrescita buonaBlu
Salmonella enteritidis ATCC 13076DirettoCrescita buonaBlu
Salmonella typhimurium ATCC 14028DirettoCrescita buonaBlu
Shigella flexneri ATCC 12022DirettoInibizione totale o parzialeVerde
Shigella sonnei NCTC 8574DirettoInibizione totale o parzialeVerde
Tabella 2 – Elenco dei risultati attendibili su questo terreno di coltura [Fonte: Scheda tecnica NEOGEN]

Perciò, una reazione positiva è indicata sia dalla crescita che dal viraggio del colore del terreno di coltura verso il blu (reazione alcalina). Al contrario, una reazione negativa è segnalata dall’inibizione della crescita, o da una crescita limitata, in assenza di cambiamento di colore del terreno.

Immagini

I risultati della crescita e della reazione sono visibili nella figura 2 e nella figura 3 sottostanti:

A sinistra, provette con terreno di coltura con reazione di viraggio negativa (sx) e positiva (dx), a destra terreno di coltura in piastra non seminato (sx) e seminato con Enterococcus (dx)
Figura 2 – A sinistra, provette con terreno di coltura con reazione di viraggio negativa (sx) e positiva (dx), a destra terreno di coltura in piastra non seminato (sx) e seminato con Enterococcus (dx) [Fonte: microbiologyinfo.com]
immons citrate agar seminato con microrganismi positivi (sx) e negativi (dx) al viraggio e all'utilizzo del citrato.
Figura 3 – Simmons citrate agar seminato con microrganismi positivi (sx) e negativi (dx) al viraggio e all’utilizzo del citrato [Fonte: lumen learning]

Limitazioni

I microrganismi fastidiosi, a causa delle loro complicate esigenze nutrizionali, potrebbero non proliferare, o farlo in maniera limitata su questo terreno. Tuttavia, questo non avrebbe nulla a che fare con il metabolismo del citrato. Inoltre, alcuni microrganismi citrato positivi richiedono un’incubazione di almeno 48 h affinché il viraggio di colore del mezzo risulti evidente.

Controllo di qualità

Per un controllo di qualità adeguato è necessario seguire queste indicazioni:

  • Le polveri (Fig.4) per preparare il terreno devono apparire gialline e omogenee.
  • Il terreno deve essere compatto e resistente, comparabile come consistenza ad un 1,5% di gel d’agarosio.
  • Il pH del mezzo deve essere compreso tra 6,60 e 7,00 (soluzione al 2,43% w/v a 25°C).
Terreno di coltura in polvere
Figura 4 – Terreno di coltura in polvere. [Fonte: megalab.vn]

Le caratteristiche del terreno incubato a 35-37°C per 18-24°C devono rispettare quanto riportato in Tabella 3:

MicrorganismoInoculo (CFU)CrescitaUtilizzo del citrato
Klebsiella aerogenes
ATCC 13048
50-100Buona-OttimaPositiva, colore blu
Escherichia coli ATCC
25922
>=104Inibita
Salmonella Typhi ATCC
6539
50-100Debole-BuonaNegativa, colore verde
Salmonella Typhimurium
ATCC 14028
50-100Buona-OttimaPositiva, colore blu
Shigella dysenteriae ATCC 13313>=104Inibita
Salmonella Choleraesuis
ATCC 12011
50-100Buona-OttimaPositiva, colore blu
Salmonella Enteritidis ATCC
13076
50-100Buona-OttimaPositiva, colore blu
Tabella 3 – Aspetti da considerare per il controllo qualità del terreno [Fonte: Scheda tecnica HIMEDIA]

Fonti

  • Scheda tecnica HIMEDIA;
  • Scheda tecnica NEOGEN;
  • Baird R.B., Eaton A.D., and Rice E.W., (Eds.), 2015, Standard Methods for the Examination of Water and Wastewater, 23rd ed., APHA, Washington, D.C.;
  • Jorgensen,J.H., Pfaller , M.A., Carroll, K.C., Funke, G., Landry, M.L., Richter, S.S and Warnock., D.W. (2015) Manual of Clinical Microbiology, 11th Edition. Vol. 1.
Crediti tabelle
Crediti immagini
Foto dell'autore

Giulia Baldi

Biologa A iscritta all'albo professionale. Laureata in Scienze Biologiche e in Biologia Agro-Ambientale con tirocini in ambito clinico (laboratorio di microbiologia e virologia) e ambientale (laboratorio di ricerca in interazioni pianti-ambiente). Master di II livello in Sicurezza Alimentare e Sistemi di Gestione.

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