Utilizzo del PALCAM agar
Il PALCAM agar (agar per Listeria PALCAM o PALCAM Listeria agar, Fig. 1) è un terreno differenziale selettivo utilizzato per la rilevazione e l’isolamento di Listeria monocytogenes ed altre Listeria spp. da campioni alimentari (ad esempio campioni di latte non pastorizzato e/o derivati) e clinici. Esso venne descritto da Van Netten et al. (1989), come miglioramento del terreno “Oxford” e spinti dalla ricerca di un terreno più selettivo di quelli precedentemente usati che non lo erano abbastanza. Il PALCAM agar è consigliato per campioni con elevata concentrazione di flora microbica accessoria. L’isolamento di Listeria su PALCAM agar può derivare dalla semina diretta del campione sulla piastra e successiva incubazione. Il terreno può essere utilizzato per il mantenimento del ceppo d’interesse partendo da coltura pura in brodo di crescita.
La presenza di polimixina B, cloruro di litio, acriflavina e ceftazidime rendono il terreno selettivo. Il PALCAM agar, per di più, ha un doppio sistema indicatore basato su l’idrolisi dell’esculina e la fermentazione del mannitolo. Listeria spp. idrolizza l’esculina ma non fermenta il mannitolo (colonie con alone nero-marrone, reazione con ioni ferrici); Staphylococcus aureus, invece, fermenta il mannitolo, e la reazione comporta il viraggio del colore (alone rosso-giallo, produzione di acidi).
Composizione del PALCAM agar
Il formulato per la preparazione del PALCAM agar è il seguente (Fonte: Becton Dickinson):
- 1 litro di acqua distillata;
- 39 grammi di Columbia Blood Agar Base;
- 10 grammi di mannitolo;
- 0,5 grammi di glucosio;
- 1 grammo di esculina;
- 0,5 grammi di citrato ferrico di ammonio;
- 15 grammi di cloruro di litio;
- 0,08 grammi di rosso fenolo;
- 0,005 grammi di acriflavina HCl;
- 0,01 grammi di solfano di polimixina B;
- 0,008 grammi di ceftazidime;
- 2 grammi di agar Bacto.
Ingredienti e dosi potrebbero cambiare leggermente in base all’azienda produttrice del formulato commerciale. Per di più la formula può essere corretta e/o compensata in base ai criteri di rendimento. In alcuni formulati commerciali polimixicina B, ceftazidime e acriflavina sono vendute separatamente in una fiala (supplemento antimicrobico PALCAM).
Preparazione del terreno
Il PALCAM agar ha una preparazione leggermente differente in caso si abbia la presenza della fiala di supplemento antimicrobico o no. In ogni caso il formulato, nelle dosi del paragrafo precedente, va sospeso in 1 litro di acqua distillata fredda in un becker. Posizionare il becker su una piastra e portare ad ebollizione mentre si mantiene la soluzione in agitazione. Fatto questo passaggio si può passare alla sterilizzazione in autoclave con un ciclo da 15 minuti a 121°C. Il terreno pronto va lasciato raffreddare fino a 50°C e va aggiunta, nel caso sia separata, una fiala di supplemento. Infine, mescolare il terreno e distribuirlo su piastre di Petri sterili.
Risultati di crescita
La crescita del batterio su PALCAM agar avviene dopo un periodo di incubazione di 24-48 ore a una temperatura tra i 35 e i 37°C, in condizioni microaerofile (limitazione per la crescita di Bacillus e Pseudomonas) o aerobiche. Listeria è visibile sulla piastra con colonie di circa 2 mm di colore grigio-verdastro con il centro infossato nero, con un alone nero intorno. Non c’è viraggio al colore giallo come succede per altri batteri (indicatore).
| Specie | Risultati della crescita |
| L. monocytogenes | Crescita da discreta ad eccellente, colonie grigio-verdastre con alone nero |
| Candida albicans | Completa inibizione |
| Escherichia coli | Parziale o completa inibizione |
| Enterococcus faecalis | Completa inibizione |
| Pseudomonas aeruginosa | Parziale o completa inibizione |
| Staphylococcus aureus | Parziale inibizione, colonie gialle con alone giallastro |
Immagini
Limitazioni del terreno
La principale limitazione del PALCAM agar è che le colonie di Listeria spp. crescono tutte con aspetto identico e, di conseguenza, per l’identificazione dei ceppi è necessario l’utilizzo di altri test più specifici. Alcuni ceppi di Listeria spp. possono crescere lentamente quindi, in caso di mancato sviluppo entro le 24 ore, le piastre devono essere mantenute in incubazione per ulteriore tempo. Per di più, se Listeria è poco presente nel campione è necessario intervenire prima con un pre-arricchimento.
Inoltre, se il terreno viene incubato in alcune condizioni come la microaerobiosi o aerobiosi con aggiunta di anidride carbonica possono avvenire dei fenomeni di modificazione del colore. Il motivo di questo fenomeno è la simulazione di una falsa fermentazione del mannitolo che fa virare l’indicatore del pH rosso fenolo da rosso a giallo-arancio. Per questo motivo è meglio utilizzare l’atmosfera aerobica classica.
Fonti
- www.biolifeitaliana.it
- www.legacy.bd.com
- www.microbiol.it
- www.oxoid.com
- www.sigmaaldrich.com
- Van Netten, P. et al. “Liquid and solid selective differential media for the detection and enumeration of L. monocytogenes and other Listeria spp.” International journal of food microbiology 8.4 (1989): 299-316.
