CHROMagar Orientation Medium

Perché si usa?

CHROMagar Orientation Medium è un terreno di coltura di orientamento (Fig.1) sviluppato da A. Rambach e commercializzato dalla BD Diagnostic System.
Il terreno non selettivo è utile per l’isolamento, l’identificazione diretta, la differenziazione e la conta di agenti patogeni del tratto urinario.
Permette di differenziare ed identificare l’Escherichia coli e gli enterococchi senza ulteriore test di conferma.

Tra i principali patogeni (60-70% delle infezioni) delle vie urinarie si possono citare i gruppi di E. coli, enterococchi, Klebsiella, Enterobacter, Serratia, Proteus, Morganella e Providencia, accompagnati da Staphylococcus saprophyticus e Streptococcus agalactiae con minor frequenza e specialmente nei pazienti donna.
Data la diversa sensibilità microbica dei vari microrganismi, per poter intraprendere un’efficacie e mirata terapia antibiotica, è necessario identificarli con estrema precisione.
L’identificazione attuale viene condotta tramite test biochimici di consumo del substrato che, tuttavia, risultano essere tra le procedure più lungo attuate nei laboratori diagnostici.

Come funziona?

Alcuni dei microrganismi patogeni sopra citati producono enzimi per il metabolismo del lattosio e di altri glucosidi.
Per esempio, E. coli possiede enzimi per il metabolismo del lattosio ma non è dotato di beta-glucosidasi, al contrario, diverse Enterobacteriaceae presentano beta-glucosidasi e non gli enzimi per il lattosio.
E’ proprio grazie all’espressione di diverse tipologie di enzimi che avviene l’identificazione: la miscela cromogena, infatti, rilascia composti dal diverso colore a seconda di quale enzima è responsabile la sua degradazione. Questo assicura la differenziazione diretta di alcune specie, o la rilevazione di determinati gruppi di organismi, mediante semplici test di conferma.

Procedura del test

Per il corretto svolgimento del test è necessario prelevare un campione di urina ben miscelata tramite un’ansa calibrata da 0,01-0,001 mL.
Dopo aver caricato adeguatamente l’ansa, si procede con l’inoculo del campione a metà della piastra con una sola strisciata da cui espandere ulteriormente l’inoculo (metodo a T).
Successivamente, le piastre vanno incubate in posizione invertita a 35-37°C, in anaerobiosi, per 20-24 h.
E’ assolutamente necessario evitare di esporre il terreno di coltura alla luce durante l’incubazione quest’ultima, infatti, degrada i cromogeni essenziali per la reazione.
Al termine dell’incubazione, quando la colorazione è ormai evidente, è possibile esporre la piastra a sorgenti luminose.

Composizione del terreno

I reagenti che permettono la reazione cromogena e la crescita dei microrganismi sono indicati in Tabella 1 con formula per litro di acqua purificata:

REAGENTE	QUANTITA’
Cromopeptone	16,1 g
Miscela cromogena	1,3 g
Agar	15,0 g

Tabella 1– Composizione del terreno di coltura CHROMagar Orientation [Fonte: instruction for use CHROMagar Orientation].

Il pH finale del mezzo risulta essere di 6,9.
Le piastre vanno conservate al buio a temperatura compresa tra i 2 e gli 8°C, nella confezione originaria e fino alla data di scadenza indicata.

Risultati della crescita

Al termine del periodo di incubazione, sulle piastre dovrebbero essersi sviluppate delle colonie isolate laddove la diluizione sia stata fatta correttamente.
Per la loro identificazione o differenziazione si fa riferimento alla Tabella 2, oppure si possono utilizzare i risultati come linee guida da accostare ad ulteriori test di conferma.

MICRORGANISMO	ASPETTO COLONIE SU CHROMagar Orientation	TEST DI CONFERMA
E. coli	Colonie medio-grandi, dal rosa scuro al rosa acceso, trasparenti, con o senza aloni sul terreno circostante
Gruppo KES^(a)	Colonie medie, dall’azzurro al blu scuro, con o senza aloni violetti	BBL CRYSTAL E/NF per differenziazione entro il genere
Gruppo PMP^(b)	Colonie dal bianco al beige circondate da aloni marroni^(c)	Indolo, H₂S^(d) BBL CRYSTAL E/NF per la differenziazione entro il genere
Enterococco	Piccole colonie verdi-azzurre
S. agalactiae	Colonie piccole, dal verde-azzurro chiaro al blu, con o senza aloni	PYR
S. saprophyticus	Colonie piccole e opache, dal rosa chiaro al rosa acceso, con o senza aloni	Disco della novobiocina da 5 ug
Altro (compresi i lieviti)	Pigmentazione naturale (panna)	Test di identificazione biochimici o sierologici

Tabella 2 – Riferimenti per l’identificazione o differenziamento delle colonie sviluppatesi su CHROMagar Orientation [Fonte: instruction for use CHROMagar Orientation]

(a) = gruppo Klebsiella, Entrobacter, Serratia
(b) = gruppo Proteus, Morganella, Providencia
(c) = il colore dall’ambra al marrone scuro è dovuto alla triptofano deaminasi (TDA), comune a tutti gli organismi che fanno parte del gruppo PMP. Circa il 50% dei ceppi di Proteus vulgaris produce colonie blu su terreno da ambra marrone
(d) = test convenzionale per l’acido solfidrico

Per l’identificazione con i test di conferma si procede come previsto dalla Fig. 2:

Linee guida per l'utilizzo dei test di conferma — *Figura 2 – Linee guida per l’utilizzo dei test di conferma [Fonte: instruction for use CHROMagar Orientation]*

Immagini esemplificative

Aspetto delle colonie dei diversi microrganismi su CHROMagar Orientation (Fig. 3):

*Figura 3 – Morfologia caratteristica delle colonie dei diversi microrganismi sul terreno di coltura [Fonte:* *sfamjournals.onlinelibrary.wiley.com*]

Limitazioni del terreno

CHROMagar Orientation è un terreno di coltura cromogeno per l’identificazione diretta, la differenziazione e la conta di agenti patogeni comuni del tratto urinario.
Tuttavia, essendo un terreno non selettivo supporterà la crescita anche di altri microrganismi non direttamente correlati.
Per questo, le colonie che presentano il loro colore naturale (panna) e che non hanno reagito con i cromogeni, dovranno essere ulteriormente differenziate con test biochimici o sierologici adeguati.

Inoltre, i bacilli Gram-negativi diversi da quelli del gruppo KES, possono dare luogo a colonie di grandi dimensioni e dal colore blu.
Anche in questo caso si procede con l’identificazione biochimica più specifica.
Molto raramente, isolati di Aeromonas hydrophila possono formare colonie dal rosa al rosa acceso simili a quelle di E. coli.
Possono essere differenziati tramite un test per l’ossidasi (Aeromonas positivo e E. coli negativo).

Il terreno di coltura non supporta la crescita di microrganismi esigenti come Neisseria, Haemophilus e Mycoplasma spp.