CHROMagar™ C. difficile

Perché si usa?

Il batterio anaerobio Clostridioides difficile (prima Clostridium difficile) é riconosciuto globalmente come il principale responsabile della diarrea legata all’utilizzo di antibiotici, soprattutto in pazienti con alterazione del microbioma intestinale, con difese immunitarie soppresse e/o anziani, in ricovero prolungato.

Sebbene i metodi rapidi (PCR e immunocromatografia) di identificazione di geni correlati alle tossine, effettuati direttamente da campioni clinici, siano rapidi e sensibili, tuttavia la coltura di isolati tossigenici è il gold standard per la diagnosi delle infezioni da C. difficile.

Per questa ragione, é indispensabile poter sviluppare terreni di coltura che permettano di ottenere risultati nel minor tempo possibile (in genere, sono necessarie 48 ore di incubazione con la maggior parte dei terreni disponibili).

Il terreno “CHROMagar C.difficile” è un innovativo terreno di coltura fluorogenico, selettivo e sensibile, che permette di identificare colonie di C. difficile in 24 ore, sotto l’effetto di luce UV  a 365 nanomentri.

Composizione del terreno

Nella formula base (54,7 g/L) del terreno si trovano i seguenti componenti:

• Agar 15,0 g
• Estratto di peptone e lievito 25,0 g
• Sali 9,0 g
• Fattori di crescita 4,0 g
• Miscela cromogenica 1,7 g

É presente anche il mezzo liofilizzato di supplemento “miscela selettiva” (325g/L).

Conservazione della polvere del terreno di base a 15/30 °C e del supplemento a 2-8 ºC. Mantenere a un pH: 7,8 ± 0,2. Durata di conservazione 2 anni.

Preparazione del terreno

• Sospendere lentamente 54,7g di base in polvere in 1L di acqua purificata;
• Mescolare fino a quando l’agar non si è addensato bene;
• Riscaldare fino all’ebollizione (100 °C), mescolando regolarmente.  Nota: É importante NON riscaldare oltre i 100 °C e NON sterilizzare in autoclave a 121°C;
• Raffreddare a 45-50 °C, mentre si mescola fino ad omogeneizzazione;
• Reidratare 325 mg di supplemento, con 3 mL di acqua sterile e agitare bene fino a completa dissoluzione;
• Sterilizzare per filtrazione (filtri di 0,45μm);
• Aggiungere la soluzione reidratata alla base raffreddata a 45-50 °C;
• Mescolare delicatamente fino ad omogeneizzare;
• Versare in piastre Petri sterili e lasciare solidificare e asciugare;

Conservare al buio prima dell’uso. I terreni possono essere conservati per un giorno a temperatura ambiente o fino a un mese in frigorifero (2/8 °C), se adeguatamente preparati e protetti dalla luce e dalla disidratazione.

Risultati della crescita

Per controllare la corretta preparazione del terreno si possono usare ceppi ATCC (sono elencati di seguito quelli approvati per il fabbricante):

Immagini

Le colonie di C. difficile appaiono come incolori e fluorescenti sotto un raggio UV di 365 nm, mentre gli altri batteri non crescono per inibizione.

Limitazione del terreno

I laboratori che scelgono di utilizzare questo terreno di coltura devono possedere sistemi di luce UV a 365nm, visto che la interpretazione ad una lunghezza d’onda differente riduce la specificità e la sensibilità dello stesso.

Fonti

• Chang, F. C., Liu, C. P., Sun, F. J., & Lin, C. C. (2019). Optimizing laboratory workflow for the diagnosis of Clostridiodes difficile infection in a medical center in Northern Taiwan. Journal of Microbiology, Immunology and Infection.
• H. Roux, R. Le Guern, R. J. Courcol, O. Gaillot (2014). Comparison of CHROMagar C. difficile and Taurocholate­-CCFA Media for Isolation of Toxigenic Clostridium difficile from Stools.2014 http://www.chromagar.com/fichiers/1405697639ASM_2053_Olivier_GAILLOT_1_.pdf
• Van Broeck Johan, Ngyuvula Mantu Eléonore, Soumillion Kate and Delmée Michel (2014). Evaluation of a new 24 h culture medium for the isolation of Clostridium difficile from stool samples http://www.chromagar.com/fichiers/1400074091Poster_CHROMagar_C.difficile_ECMID_2014_.pdf
• http://www.chromagar.com/clinical-microbiology-chromagar-c-difficile-focus-on-clostridium-difficile-69.html