Burkholderia Cepacia Selective Agar

Perché si usa il Burkholderia Cepacia Selective Agar?

Burkholderia Cepacia Selective Agar (BCSA) è un terreno di coltura impiegato in microbiologia clinica per l’isolamento di Burkholderia cepacia complex (Bcc) principalmente da campioni di origine respiratoria ed in microbiologia industriale per la verifica dell’assenza di Bcc nei prodotti farmaceutici non sterili.

Cos’è Burkholderia cepacia complex (Bcc)?

Burkholderia cepacia complex (BCC), o semplicemente Burkholderia cepacia, è un gruppo di beta-proteobatteri Gram-negativi non fermentanti, aerobi, ossidasi e catalasi positivi, a forma di bastoncino, composto da più di 20 specie (26 secondo NIH) geneticamente distinte, tra cui B. cepacia, B. multivorans, B. cenocepacia, B. vietnamiensis, B. stabilis, B. ambifaria, B. dolosa, B. anthina, B. pyrrocinia e B. ubonensi.

Questi batteri hanno un’ampia distribuzione ambientale, una straordinaria versatilità metabolica, un genoma complesso e un’elevata capacità di mutazione e rapido adattamento.

Sono patogeni opportunisti in pazienti ventilati meccanicamente, immunodepressi, neonati, anziani e persone con gravi patologie di base; Bcc (soprattutto B. cenocepacia e B. multivorans), si ritrovano frequentemente nelle infezioni dei pazienti con fibrosi cistica e sono causa dell’aggravamento del loro quadro clinico.

Bcc è in grado di formare biofilm nei sistemi farmaceutici acquosi e di resistere ai conservanti ed ai disinfettanti. Bcc rappresenta una delle cause più frequenti dei richiami dal mercato americano dei prodotti farmaceutici. Per queste ragioni, USP ha definito un metodo d’analisi per verificarne l’assenza nei prodotti farmaceutici non sterili.

Un po’ di storia

Questi batteri furono descritti per la prima volta nel 1950 dal patologo vegetale americano Walter Hagemeyer Burkholder della Cornell University, come causa di marcescenza del bulbo delle cipolle e della colonizzazione della rizosfera di molte specie vegetali. Fino al 1992 rimasero inseriti nel genere Pseudomonas, specie cepacia.

In seguito, P. cepacia ed altre otto specie furono attribuite al nuovo genere Burkholderia, in onore del suo scopritore. La tassonomia del nuovo genere ha subito forti rimaneggiamenti fino ad arrivare ad includere nel Bcc le attuali specie. Il terreno BCSA è stato sviluppato nel 1997 da D.A. Henry e col l. (University of British Columbia, Vancouver) per superare i limiti delle scarse proprietà selettive e differenziali dei terreni disponibili al tempo.

Composizione del terreno Burkholderia Cepacia Selective Agar

Il terreno è costituito da una base autoclavabile e da un supplemento selettivo, contenente antibiotici.

Terreno di base (x litro)

Peptone di caseina 10,0 g

Estratto di lievito 1,5 g

Lattosio 10,0 g

Saccarosio 10,0 g

Sodio cloruro 5,0 g

Rosso fenolo 80,0 mg

Violetto cristallo 2,0 mg

Agar 14,0 g

Supplemento selettivo (x litro)

Vancomicina 2,5 mg

Gentamicina 10,0 mg

Polimixina B 600.000 UI

pH finale (20-25°C): 6,8 ± 0,3

Come funziona?

Il peptone di caseina e l’estratto di lievito forniscono azoto, carbonio, vitamine e minerali per la crescita microbica. Il sodio cloruro mantiene l’equilibrio osmotico. La formulazione include due zuccheri, il lattosio ed il saccarosio: la maggior parte dei ceppi di Bcc ossida sia il lattosio che il saccarosio ed i prodotti finali acidi fanno sì che il terreno di coltura viri dall’arancione al giallo per la presenza dell’indicatore di pH, il rosso fenolo. Come nel MacConkey Agar, il terreno BCSA include il violetto cristallo per sopprimere la crescita dei batteri Gram positivi, soprattutto stafilococchi, ma con dei limiti nell’inibizione degli enterococchi. Questi limiti sono superati dall’inclusione della vancomicina un glicopeptide con una eccellente attività battericida verso gli enterococchi ed una serie di altri batteri Gram-positivi. La polimixina e la gentamicina agiscono in modo sinergico nel sopprimere la crescita di numerosi bacilli aerobi Gram negativi, compreso Pseudomonas.

Preparazione del terreno

A 50,6 g di terreno aggiungere in 1000 ml di acqua purificata sterile e mescolare con cura. Scaldare fino ad ebollizione sotto agitazione ed autoclavare a 121°C per 15 minuti. Raffreddare a 45-50°C ed addizionare, con le precauzioni dell’asepsi, le soluzioni acquose degli antibiotici sterilizzate per filtrazione, per ottenere le concentrazioni finali richieste. In alternativa, addizionare il supplemento selettivo liofilizzato disponibile commercialmente, ricostituito secondo le indicazioni del produttore. Mescolare bene e distribuire in piastre di Petri sterili.

Metodo di semina

Campioni clinici (soprattutto espettorato, tampone faringeo profondo, lavaggi bronco alveolari, aspirato ipofaringeo).

Inoculare la piastra di BCSA con 100 µl di espettorato fluidificato o di liquido di lavaggio bronchiale o depositando il materiale raccolto con il tampone. Strisciare con l’ansa su quattro settori della piastra per ottenere colonie isolate. Incubare a 35-37°C per 48-72 ore.

Campioni farmaceutici (soprattutto farmaci per uso inalatorio o preparati acquosi per uso orale, per la mucosa orale, per uso cutaneo o nasale)

Preparare una diluizione 1:10 del campione da esaminare in Tryptic Soy Broth, usando non meno di 1 g o 1 ml di prodotto. Incubare a 30-35°C per 48-72 ore. Trapiantare dalla brodocoltura su piastra di BCSA e strisciare con l’ansa su quattro settori della piastra per ottenere colonie isolate. Incubare a 30-35°C per 48-72 ore.

Risultati della crescita in Burkholderia Cepacia Selective Agar

Le colonie tipiche di Bcc appaiono bruno-verdastre con alone giallo. L’ingiallimento del terreno di coltura indica la fermentazione dei carboidrati e può non verificarsi con tutti i ceppi di Bcc che possono quindi crescere anche con colonie circondate da una zona rosa-rossa.
Poiché Bcc può crescere con colonie tipiche ed atipiche, qualsiasi crescita sulla piastra deve essere considerata come un risultato positivo e le colonie, previa purificazione, devono essere sottoposte a prove di identificazione.

Immagini del Burkholderia Cepacia Selective Agar

*Figura 1 – Burkholderia cepacia complex su terreno BCSA: a sinistra: colonie tipiche (lattosio e/o saccarosio positive), a destra: colonie atipiche di Bcc (lattosio e saccarosio negative)*

Controllo qualità

I terreni ed i supplementi disponibili commercialmente sono sottoposti a rigorosi controlli di qualità per verificarne la conformità alle specifiche. L’utilizzatore può comunque eseguire il proprio controllo di qualità sulle piastre preparate in laboratorio, in funzione dei requisiti regolamentari e delle norme di accreditamento. USP suggerisce i seguenti ceppi:

Ceppo	Collezione	Inoculo	Risultati attesi
B. cepacia	ATCC 25416, NCTC 10743, CIP 80.24	100 UFC/piastra	buona crescita
B. cenocepacia oppure B. multivorans	ATCC BAA-245, LMG 16656 ATCC BAA-247, LMG 13010, CCUG 34080, CIP 105495, DSM 13243, NCTC 13007	100 UFC/piastra	buona crescita
P. aeruginosa	ATCC 9027, NCIMB 8626, CIP 82.118, NBRC 13275	Almeno 100 UFC/piastra	nessuna crescita
S. aureus	ATCC 6538, NCIMB 9518, CIP 4.83, NBRC 13276	Almeno 100 UFC/piastra	nessuna crescita

Incubazione a 35°C per 48 ore in aerobiosi

Limitazioni all’utilizzo del terreno

Sebbene il terreno contenga un’alta concentrazione di polimixina che può essere inibitoria per la crescita fungina, nel BCSA non è presente un agente selettivo specifico per i lieviti ed i funghi filamentosi.
Sebbene il terreno sia altamente selettivo per i batteri Gram-negativi, è stata segnalata la crescita, comunque modesta, di bacilli Gram-negativi diversi da Bcc, come Burkholderia gladioli e Chriseobacterium indologenes. L’ossidazione del maltosio e del lattosio può essere usata per separare Bcc (+) da B. gladioli (-); il test dell’indolo può essere impiegato per separare C. indologenes (+) da Bcc (-)
Su BCSA possono crescere ceppi di Stenotrophomonas maltophilia resistenti alla colistina. Il test della DNasi con incubazione a 72 ore può essere impiegato per differenziare S. maltophilia (+) da Bcc (-).
Pur essendo riconosciuta la superiorità del terreno BCSA per l’isolamento di Bcc, è stata segnalata la mancata crescita su di esso di alcuni ceppi di Bcc sensibili agli antibiotici presenti nel terreno.