Sequenziamento Nanopore: una tecnologia innovativa

Caratteristiche generali

La Oxford Nanopore Technologies è stata fondata nel 2005 dal da Dr. Gordon Sanghera, Dr Spike Willcocks, e dal Professor Hagan, per sviluppare un sistema di riconoscimento basato sui nanopori. Il primo prodotto basato sul sequenziamento Nanopore, il MinION, è stato introdotto in accesso anticipato nel 2014 e reso disponibile in commercio nel 2015. I successivi prodotti sono stati il GridION, lanciato in commercio nel 2017, il PromethION nel 2018, ed il PromethION 48 nel 2019. Quest’ultimo è il più grande dei dispositivi, capace di produrre un massimo di 14 Tb.

Il sequenziamento Nanopore si basa sull’uso di nanopori inseriti in una membrana elettro-resistente, attraversata da una corrente ionica. Quando una molecola di DNA/RNA passa attraverso il poro, causa una specifica alterazione nel flusso di corrente che dipende dalle basi (di solito 3-meri) presenti nel poro. Durante il passaggio della molecola di DNA/RNA attraverso il poro, vengono fatte numerose misurazioni, e l’alterazione di corrente viene convertita da un software di basecalling nella corrispettiva sequenza genomica.

Il sequenziamento Nanopore offre la possibilità di:

sequenziare frammenti di DNA/RNA;
sequenziare direttamente DNA/RNA nativo, indipendente dalla lunghezza;
avere dati disponibili in tempo reale;
preparare una libreria in maniera semplice/automatizzata.

Flow Cell

Tutti i dispositivi di sequenziamento Oxford Nanopore si basano sulle Flow Cell, poiché è qui che sono alloggiati i nanopori. Queste contengono 512 canali, ognuno in grado di sequenziare frammenti di DNA indipendenti. Poiché ogni canale contiene 4 nanopori, una Flow Cell è composta da circa 2048 nanopori.

Le principali caratteristiche della parte superiore sono:

Priming port cover: copre la priming port al di sotto, viene aperto quando deve essere inserito il buffer di sequenziamento o per lavare la cella a fine corsa;
SpotON: coperto da un’apposita copertura, permette di caricare la libreria direttamente sopra la matrice di sensori;
Matrice di sensori: contiene fino a 2048 pozzetti, ognuno progettato per contenere un singolo nanoporo;
Camera dello scarto: ha la capacità di contenere fino a 1.9 ml di scarto, permette attraverso la “waste port” di eliminare il buffer/scarto in eccesso utilizzando una pipetta.

Vista della parte inferiore di una Flow Cell pre sequenziamento nanopore — *Figura 2 – Vista della parte inferiore di una Flow Cell*

La parte inferiore contiene:

ASIC: Il Circuito Integrato Specifico dell’Applicazione, che è connesso alla matrice di sensori e misura la corrente ionica che attraversa I nanopori, fornendo una lettura digitale del flusso della corrente. Riceve comandi dal software MinKNOW, che controlla l’acquisizione della frequenza, del segnale, della variazione di corrente, capace di modificare la differenza di potenziale, e in grado di selezionare i sensori non disponibili;
Tappeto termico: essenziale per il controllo delle temperature, protegge l’ASIC da improvvise variazioni di temperature che possono influire sull’integrità dei pori attivi;
Spinotti connettori: responsabili di trasmettere i dati al software, così da poter fare le misurazioni elettrofisiologiche mentre la corrente che passa attraverso i pori cambia.

In generale la Flow Cell è composta da tre parti principali:

Il reservoir comune;
Il bulk buffer;
Il buffer nei pozzetti.

Compartimenti principali di una Flow Cell per sequenziamento nanopore — *Figura 3 – Compartimenti principali di una Flow Cell*

Software MinKNOW

MinKNOW è un software sviluppato dalla Oxford Nanopore Technologies per gestire i dispositivi di sequenziamento Nanopore. Ha un’interfaccia grafica molto semplice, e permette di controllare numerosi parametri di sequenziamento, incluse diverse attività fondamentali come:

i) acquisizione dei dati;
ii) analisi real-time;
iii) basecalling locale;
iv) analisi post-corsa.

In aggiunta a ciò, permette anche il controllo della corsa, e di risolvere eventuali problemi, così da assicurare un corretto sequenziamento.

Prima del sequenziamento il software esegue un controllo della Flow Cell chiamato Mux Scan, e classifica ciascuno dei 4 pori di ogni canale. Il poro più attivo viene definito “G1”, mentre quello meno attivo “G4”. Quando inizia la corsa viene usato per primo il poro “G1”, ed ogni 1.5 h questo processo viene ripetuto in modo da mantenere ottimale il sequenziamento.

Esempio dell'interfaccia MinKNOW. a) Interfaccia di controllo della lunghezza delle reads ottenute b) Interfaccia di controllo dello stato di funzionamento dei pori — *Figura 4 – Esempio dell’interfaccia MinKNOW. a) Interfaccia di controllo della lunghezza delle reads ottenute b) Interfaccia di controllo dello stato di funzionamento dei pori*

Kit di sequenziamento

Ci sono diversi tipi di kit di sequenziamento, in base al tipo di necessità dell’utente, ed ognuno è associabile a kit di barcode che permettono di sequenziare campioni diversi contemporaneamente, in un processo definito “multiplexing”. Attualmente esistono due principali kit PCR-free per il sequenziamento del genoma batterico:

Kit di ligazione (SQK-LSK109/110): si tratta di un kit PCR-free che richiede circa un’ora di preparazione, ed è ottimizzato per ottenere il massimo rendimento. È compatibile con processi precedenti come ad esempio la “size selection”, amplificazione “whole genome”, ed il “target enrichment”. Permette inoltre di avere un controllo sulla lunghezza dei frammenti di DNA (rendendo più facile ottenere “ultra long” reads);

Kit rapido (SQK-RBK004): metodo veloce e semplice per preparare una libreria di DNA genomico, usando come input un totale di 400 ng di DNA ad alto peso molecolare. Permette di creare una libreria in circa 10 minuti attraverso un protocollo in due passaggi. La chiave di questo protocollo è l’uso di una trasposasi che simultaneamente taglia e attacca le sequenze “tag” alla fine dei frammenti. SI tratta di un kit ottimizzato per essere rapido e semplice, non per ottenere il massimo rendimento possibile.

Entrambi i kit possono essere associati a kit di barcode che consentono di sequenziare fino a 96 campioni insieme.

Vantaggi

Uno dei vantaggi di questo tipo di tecnologia è sicuramente il costo, infatti è possibile fare un sequenziamento con circa 1000 $, e la possibilità di fare multiplexing permette di abbassare ulteriormente il costo per campione.

Altro punto di forza sta nella possibilità di generare le cosiddette “ultra-long reads”. Queste sono sequenze di DNA con una lunghezza superiore alle 100 kb, che facilitano processi successivi come l’assemblaggio de novo del genoma o di eventuali elementi mobili.

Svantaggi

Il principale svantaggio del sequenziamento Nanopore è la ridotta accuratezza (~98%) rispetto ad altre tecnologie, sopratutto in presenza di sequenze omopolimeriche.