L’HPLC (Parte 2)

Continua la descrizione dell’HPLC, per visionare la prima metà dell’articolo seguite il link: L’HPLC (Parte 1).

Utilizzo in laboratorio

Nella prima parte dell’articolo sono state definite le funzioni dell’HPLC, come la separazione di sostanze, la valutazione di purezza o la concentrazione di determinati componenti di un campione (Fig. 1). L’HPLC è uno strumento versatile che trova applicazioni in diversi ambiti di ricerca. Nel settore farmaceutico può essere utilizzato nella sintesi di nuovi farmaci oppure nelle analisi qualitative di materie prime o formulati (purezza, uniformità, stabilità). Nel campo biologico, genetico e biotecnologico, l’HPLC può essere utilizzato per analisi su peptidi, proteine ed amminoacidi ma anche per separare RNA o DNA.

Interessanti sono gli utilizzi di questo strumento in ambito ambientale, ad esempio il controllo delle acque alla ricerca di residui di fitofarmaci ed erbicidi utilizzati in agricoltura o inquinanti industriali. L’HPLC può essere utilizzato anche in campo alimentare con varie applicazioni: la ricerca di contaminanti (fitofarmaci, micotossine, antibiotici), la caratterizzazione dei diversi componenti (zuccheri, aminoacidi, acidi organici, polifenoli ecc) e le analisi di additivi alimentari (ad esempio i coloranti).

Nel settore chimico vengono fatte analisi di caratterizzazione di polimeri (determinazione e controllo della qualità) o saggi di purezza sui prodotti sintetizzati.

Funzionamento

Il funzionamento dell’HPLC ha come fondamenti la cromatografia liquida il cui principio è l’equilibrio chimico-fisico che risulta quando una sostanza è distribuita in due fasi. Come già affermato precedentemente le fasi sono una mobile (liquida, con le componenti da separare del campione) e una stazionaria (solida). I componenti vengono disciolti in una solvente per poi essere spinti, grazie a una pompa, all’interno della colonna applicando una pressione molto alta. Le componenti interagiscono con i costituenti della fase stazionaria e quindi fuoriescono in momenti diversi.

Le bande di soluto si espandono e si separano durante il passaggio nella colonna; quando una banda esce dalla colonna la sua concentrazione viene registrata e visualizzata come picco. I dati sono visualizzati tramite un cromatogramma (Fig. 2) ovvero un grafico con i picchi relativi alle concentrazioni delle varie sostanze rilevate presenti nel campione.

La capacità di migrare di una sostanza è determinata dal coefficiente di distribuzione (K_d), ovvero la percentuale del numero di molecole nella fase stazionaria sul numero di molecole nella fase mobile, all’equilibrio. Altri parametri fondamentali da prendere in considerazione durante l’analisi sono:

• Tempo di ritenzione: tempo richiesto a una sostanza per essere eluita;
• Fattore di ritenzione (o capacità di ritenzione): è costante per un sistema in cui ci sono la stessa fase stazionaria, fase mobile, soluto e temperatura;
• Volume di ritenzione: è il volume di fase mobile che ha fluito nella colonna al tempo di ritenzione;
• Efficienza (di una colonna): è l’ampiezza dei picchi (più è efficiente più i picchi sono stretti);
• Selettività: misura della distanza tra i diversi picchi;
• Risoluzione: termine usato per descrivere quantitativamente il risultato ottenuto.

Limiti dello strumento

L’HPLC è uno strumento che può sembrare complicato per chi si approccia per le prime analisi: la scelta delle colonne ed eluenti giusti, oltre alla comprensione del funzionamento dello strumento in sé, può bloccare un neofita. Da ricordare però che ci sono davvero molti manuali e libri che trattano questo argomento sia per la scelta delle fasi, sia per la risoluzione dei problemi. I due limiti principali dell’HPLC che lo caratterizzano sono che non è un rilevatore universale e che è meno efficiente nella separazione rispetto a un gascromatografico con colonna capillare.

I vantaggi però dell’utilizzo di questo strumento sono vari. Le analisi quantitative fatte da HPLC sono rapide e precise, per non parlare del fatto che sono automatiche, evitando perdite di tempo. I rilevamenti per di più sono ad alta sensibilità ed è adatto a campioni di vario tipo; per le analisi è necessario davvero poco campione evitando così gli sprechi.

Precauzioni di utilizzo

L’HPLC è uno strumento molto complesso, sensibile e delicato, motivo per cui è importante utilizzarlo con cautela. Prima di tutto è necessario che i campioni siano il più puliti possibile perché, sebbene ci sia un sistema di filtrazione del campione all’interno dello strumento, ciò agevola le analisi e permette di evitare incrostazioni nella colonna. Il controllo della pressione è un fattore da prendere in considerazione: essa non deve variare durante l’utilizzo, né con picchi né con cadute, per evitare problemi alla colonna e scompensi che potrebbero portare a letture errate dei campioni durante le analisi.

Oltre alle considerazioni specifiche descritte sopra, è possibile riscontrare problematiche in ogni parte dello strumento (tendenzialmente piuttosto delicate). Quando si osserva un’anomalia è bene localizzare il problema e cercarlo di correggere (ovviamente nei limiti, spesso è meglio richiedere l’aiuto di un tecnico). Sarebbe sicuramente meglio utilizzare l’HPLC con il maggior riguardo possibile e cercare di prevenire situazioni spiacevoli. La manutenzione è fondamentale per tenere l’HPLC al massimo delle sue potenzialità di analisi ed evitare danni gravi per negligenza.

A parte le pressioni anomale e la pulizia del campione, altre criticità potrebbero essere perdite o problemi all’iniettore del campione. Una volta che si ha il cromatogramma, per di più, è molto importante leggerlo nel modo giusto. Spesso ci sono problemi di interpretazione o, in caso gli eluenti o le colonne non siano adatti alle analisi, i picchi potrebbero essere deformati, troppo grandi o distribuiti in modo anomalo. È necessario ricordare che i solventi utilizzati per la fase mobile possono essere tossici e, di conseguenza, l’utilizzo e lo smaltimento di essi vanno fatti in modo sicuro, sotto cappa e con indosso i dispositivi di protezione individuale quali guanti e camice.

Fonti

• De Sio F. (1998). Introduzione all’HPLC – Manuale per corso di formazione “Addetti Controllo Qualità” 1997/1998.
• Dong M. W. (2006). Modern HPLC for Practicing Scientists. John Wiley & Sons, Inc.
• Snyder L.R, Kirkland J.J, Glajch J.L. (1997). Practical HPLC method development. A Wiley-Interscience Publication, John Wiley & Sons, Inc.
• www.bmscience.net
• www.disc.chimica.unipd.it
• www.waters.com