Colorazione Ematossilina-Eosina

Obiettivo della colorazione ematossilina- eosina

La Colorazione Ematossilina – Eosina (EE) è la più comune colorazione istologica, utilizzata prevalentemente in microscopia ottica ed applicabile con tutti i metodi fissativi, eccetto quelli che prevedono la presenza di osmio.

Cartilagine ialina in colorante Ematossilina-Eosina — *Figura 1 – Cartilagine ialina in colorante Ematossilina Eosina*

Questo tipo di colorazione consente di osservare, in chiave prettamente morfologica, un particolare organo o tessuto di un organismo animale.

Inoltre, è la colorazione base in esami istopatologici di routine, necessari per identificare alterazioni patologiche a livello di un organo o di un tessuto.

Carcinoma bronchioalveolare in Colorazione Ematossilina - Eosina — *Figura 2 – Carcinoma bronchioalveolare, colorazione Ematossilina-Eosina*

La colorazione Ematossilina – Eosina Ematossilina–Eosina è definita combinata, o meglio bicromica, in quanto vi è la combinazione dei due coloranti più comuni in campo istologico: ematossilina (o emallume acido di Mayer) ed eosina.

L’utilizzo di due coloranti diversi tra loro consente di evidenziare differentemente i costituenti di una cellula, inoltre la colorazione dipende dal valore di pH delle diverse zone cellulari.

Che cosa sono l’ematossilina e l’eosina?

È fondamentale conoscere le principali caratteristiche dei due coloranti utilizzati in questa colorazione: l’emallume acido di Mayer e l’eosina.

L’emallume acido di Mayer si prepara sciogliendo in acqua distillata diverse componenti: ematossilina, allume di potassio, iodato di sodio, cloralio idrato ed acido acetico. La componente principale è l’ematossilina, di origine vegetale, in quanto estratta da Haematoxylon campechianum, una leguminosa presente in America del Sud. L’ematossilina non è il colorante vero e proprio, ma lo diventa per ossidazione ad emateina. L’emateina esercita un’attività tintoriale solo in presenza di un mordenzante (ponte tra tessuto e colorante); nella miscela dell’emallume acido di Mayer è l’allume di potassio. In base al mordenzante utilizzato, vi sono diversi tipi di ematossilina. E’ un colorante basico, colora in blu/viola le componenti cariche negativamente (basofile), quali acidi nucleici, presenti a livello del nucleo.

Struttura chimica dell'ematossilina — *Figura 3 – Struttura chimica dell’ematossilina*

Ossidazione dell'ematossilina ad emateina (struttura chimica) — *Figura 4 – Ossidazione dell’ematossilina ad emateina*

L’eosina viene preparata all’1% in acqua leggermente acidificata; la sua composizione è la seguente: eosina 1%, Orange G 0,5% e acido acetico in gocce. E’ un derivato della fluoresceina e si presenta sotto forma di polvere cristallina di colore rosso, solubile in acqua ed in alcool. Al contrario dell’ematossilina, l’eosina è un colorante acido, colora in rosso/rosa le componenti cariche positivamente (acidofile), quali proteine cellulari, presenti a livello citoplasmatico. L’eosina al 2% invece, è utilizzata come disinfettante della cute, in quanto favorisce la cicatrizzazione. Oltre alla comune, ossia l’Y, esiste anche l’eosina B, polvere cristallina bruna solubile in acqua. La B si differenzia da quella comune per la sua struttura chimica, in quanto vi è la presenza di due gruppi nitrici al posto di due dei quattro atomi di bromo.

Figura 5 - Struttura chimica dell'eosina Y — *Figura 5 – Struttura chimica dell’eosina Y*

Struttura chimica dell'eosina B — *Figura 6 – Struttura chimica dell’eosina* B

Materiale occorrente per la colorazione emetossilina-eosina

Vetrino porta oggetti con il preparato istologico da colorare;
Xilene;
Etanolo (100˚,95˚,70˚,50˚);
Vaschette per colorazioni istologiche (tipo Coplin, Hellendahl, Schiefferdecker);
Ematossilina;
Eosina;
Pinzette a punte piatte;
Vetrino copri oggetto;
Montante resinoso.

Colorazione Ematossilina - Eosina Vaschetta per colorazione istologica di tipo Coplin — *Figura 7 – Vaschetta per colorazione istologica di tipo Coplin*

Procedimento

Il procedimento la colorazione Ematossilina – Eosina è il seguente:

Sparaffinatura ed idratazione

I vetrini con il preparato istologico sono immersi in:

Xilene, per eliminare la paraffina;
Etanolo a concentrazione sempre minore per consentire l’idratazione dato che i coloranti si utilizzano in soluzione acquosa (100˚,95˚,75˚,50˚);
Acqua distillata.

I passaggi in xilene ed etanolo hanno durata di diversi minuti.

Colorazione

Quelli sparaffinati ed idratati sono immersi nelle soluzioni coloranti e sottoposti a diversi lavaggi:

Ematossilina (da 2 a 10 minuti);
Lavaggio in acqua di fonte (da 5 a 10 minuti) che, essendo leggermente alcalina, consente il viraggio di colore dei nuclei, da violaceo ad azzurrognolo.
Lavaggio in acqua distillata, per eliminare I residui di sale dell’acqua corrente;
Eosina (da 30 secondi ad 1 minuto);
Lavaggio in acqua distillata.

Disidratazione e chiusura

I colorati vengono disidratati e chiusi tramite i seguenti passaggi:

Etanolo a concentrazione sempre maggiore per consentire la disidratazione (50˚,75˚,95˚,100˚);
Xilene, sostanza miscibile con il montante resinoso;
Montante resinoso posto sulle sezioni;
Vetrino copri oggetto lasciato cadere sul montante resinoso;
Vetrino posto in stufa fino a completo indurimento.

Sono solitamente maneggiati utilizzando delle pinzette a punte piatte.

Colorazione Ematossilina - Eosina Pinzette a punte piatte usate per maneggiare i vetrini — *Figura 8 – Pinzette a punte piatte usate per maneggiare i vetrini*

Video 1- Passaggi fondamentali da eseguire per la colorazione Ematossilina-Eosina

Osservazione del vetrino

I vetrini colorati sono osservati al microscopio ottico utilizzando qualsiasi ingrandimento, ma quello preferenziale è l’ingrandimento massimo (100x), in quanto consente di evidenziare maggiori dettagli morfologici del preparato, rispetto ad ingrandimenti minori che consentono solo una visione generale del campione.

Non dimentichiamo che utilizzando gli obiettivi a più alta risoluzione (40x, 100x), è necessario l’uso degli oli per immersione.

È proprio grazie alla colorazione Ematossilina-Eosina che durante l’osservazione microscopica riusciamo a distinguere i diversi componenti cellulari:

i nuclei hanno un colore che varia dal blu scuro al viola scuro;
il citoplasma, le sostanze intercellulari e le fibre muscolari, hanno un colore che varia dal rosa al rosso;
I fluidi presenti nei tessuti, o negli spazi interstiziali, si colorano debolmente, identificandosi come ampi spazi bianchi (sangue, linfa, etc.);
Grassi e lipidi non si colorano.