Obiettivo della tecnica
La colorazione di Kinyoun, conosciuta anche come metodo di Tan-Thiam-Hok e Devulder è una colorazione utilizzata in microscopia e batteriologia per la ricerca di batteri acido-alcool resistenti, in particolare appartenenti ai generi Mycobacterium e Nocardia. Questa tecnica rappresenta una valida alternativa alla colorazione di Ziehl-Neelsen: è bene ricordare che l’esecuzione di questa colorazione in campioni di cui si sospetta l’infezione da Mycobacterium deve avvenire rigorosamente in laboratori di biosicurezza BSL-3. La colorazione può essere eseguita utilizzando tre diversi metodi: 1) metodo di Tan-Thiam-Hok; 2) metodo di Devulder a caldo; 3) metodo di Devulder a freddo.
Funzionamento
Il principio alla base della colorazione di Kinyoun è la capacità del fenolo di permettere la penetrazione del colorante primario, la fucsina basica, all’interno della cellula batterica. Come per la Ziehl-Neelsen, il colorante di contrasto o colorante secondario è il blu di metilene; i batteri non acido-alcool resistenti, una volta sottoposti a decolorazione, perderanno la colorazione rossa data dalla fucsina e assorbiranno il blu di metilene.
Materiale occorrente
- un vetrino portaoggetto per microscopio su cui è posizionato il materiale biologico da analizzare, precedentemente fissato; la fissazione può essere svolta sia con il calore sia con metanolo.
- Soluzione di Kinyoun, composta da: fucsina basica (40 g), alcool etilico 95° C (200 mL), fenolo (80 mL), acqua distillata (1000 mL);
- Soluzione di Gabett: composta da blu di metilene (10 g), acido solforico (300 + 200 mL), acqua distillata (500 mL).
Procedimento
Questa colorazione può essere eseguita utilizzando tre procedimenti differenti; le differenze sono relativamente minime ma l’obiettivo finale, per tutti e tre, è sempre la decolorazione con acido-alcool al fine di discriminare i batteri acido-alcool resistenti dalle altre specie.
Metodo di Tan-Thiam-Hok
1) Ricoprire il vetrino con la soluzione di Kinyoun e lasciare agire per 3 minuti;
2) Lavare con acqua per circa 30 secondi;
3) Successivamente, ricoprire il vetrino con la soluzione di Gabett e lasciare agire per 1 minuto;
4) Lavare con acqua ed asciugare;
5) Osservare il vetrino al microscopio utilizzando l’obiettivo ad immersione.
Metodo di Devulder a caldo
1) Sul vetrino, aggiungere la soluzione di Kinyoun e riscaldare per 10 minuti; successivamente lavare con acqua;
2) Dopo il lavaggio, ricoprire il vetrino con la soluzione di Gabett e lasciare agire per 5 minuti;
3) Lavare con acqua ed asciugare;
4) Il vetrino è pronto per essere osservato.
Metodo di Devulder a freddo
1) Immergere il vetrino nella soluzione di Kinyoun per circa tre ore; successivamente lavare con acqua eliminando ogni residuo di soluzione;
2) Ricoprire il vetrino con la soluzione di Gabett lasciando agire per 5 minuti;
3) Lavare con acqua, asciugare e leggere al microscopio.
Osservazioni microscopiche
La lettura del vetrino viene svolta al microscopio ottico. Il livello di ingrandimento utilizzato e d’elezione è un 100x ad immersione (“oil”) . Come per la Ziehl-Nelseen, i batteri acido-alcool resistenti appariranno rossi – fucsia su sfondo blu, in cui saranno presenti tutti gli altri batteri che hanno reagito alla decolorazione.
Priscilla Caputi
Fonti
- Moroni M., Antinori S., Mastroianni C. Manuale di Malattie Infettive. Edra, 2020.
- Kenneth J. Ryan, C. George Ray. Sherris, Microbiologia Medica. The McGraw Hill Companies, 2017. Edizioni Mediche Scientifiche Internazionali.
- Cioffi M., Manuale di Diagnostica di Laboratorio. Edizioni Minerva Medica, 2010.
- B.G. Metchock, F.S. Nolte & R.J.Wallace, 1999. Mycobacterium, p.399-437 In P.R.Murray, E.J Baron, M.A. Pfaller, F.C. Tenover and R.H.Yolken (eds.). Manual of Clinical Microbiology, 7th ed. American Society for Microbiology, Washington, D.C.
- Devulder B. Ann. De l’Institut Pasteur de Lille. 1963, 14, 229-231
- http://www.amcli.it/
- http://www.biolifeitaliana.it/
- https://www.diapath.it/it/prodotto/colorazione-di-kinyoun-010315-2563
- https://www.microbiologiaitalia.it/microscopia/colorazione-di-ziehl-neelsen-carbolfucsina-a-caldo/
- https://www.microbiologiaitalia.it/didattica/livelli-di-biosicurezza/
- https://www.microbiologiaitalia.it/batteriologia/nocardia/
- https://www.microbiologiaitalia.it/batteriologia/mycobacterium-tuberculosis/
Crediti immagini
