Colorazione con Auramina: osservazione dei micobatteri

Obiettivo della tecnica

La colorazione a fluorescenza con Auramina è utilizzata in batteriologia ed in microscopia per l’osservazione dei bacilli acido – alcool resistenti ossia i micobatteri, con particolare riguardo al Mycobacterium tuberculosis. Tale colorazione è utilizzata assieme alla Ziehl – Neelsen per la ricerca e la conferma microscopica dei bacilli appena menzionati.

Il Mycobacterium tuberculosis, conosciuto anche come il Bacillo di Koch, è un bacillo immobile, non sporigeno, aerobio obbligato, agente eziologico della tubercorlosi. La tubercolosi è una patologia estremamente infettiva e contagiosa a trasmissione aerea che a tutt’oggi rientra tra le 10 principali cause di morte nel mondo. Tale bacillo, come tutti gli altri micobatteri, presenta una parete cellulare ricca in lipidi e cere, che gli conferisce la peculiarità dell’acido – alcool resistenza.

Che cos’è e come funziona?

La colorazione con Auramina è una colorazione fluorocromica, ossia in fluorescenza. Oltre a questa caratteristica rientra tra le colorazioni differenziali e di contrasto poiché prevede l’utilizzo di più reagenti e mordenzanti, che, una volta pronto il vetrino e letto al microscopio a fluorescenza, permetteranno la discriminazione specifica dei micobatteri rispetto ad altri batteri di diverso genere.

Il colorante primario è l’auramina, che colora in modo specifico i micobatteri nonostante la rigida conformazione della parete cellulare, mentre il colorante secondario (o di contrasto) è il permanganato di potassio che colora tutti gli altri batteri che subiscono la decolorazione con acido – alcool, creando un fondo scuro sui cui risalta il tipico colore dorato dei micobatteri che trattengono l’auramina.

È molto importante ricordare che di questa colorazione ne esistono diverse varianti che prevedono comunque l’utilizzo dell’auramina come colorante primario. Una variante molto usata nei laboratori prevede l’utilizzo di una miscela di auramina O e rodamina oppure, come colorante secondario, l’arancio acridina che produce uno sfondo rosso – arancio.

Materiale occorrente

un vetrino portaoggetto per microscopio su cui è posizionato il materiale biologico da analizzare, precedentemente fissato;
auramina O: preparare una soluzione contenente 0.1 g di auramina O in 10 ml di etanolo al 95%; aggiungere poi a 87 ml di acqua distillata in cui sono stati sciolti 3 g di fenolo in cristalli. Il fenolo viene aggiunto come mordenzante, in modo da amplificare e rendere più intensa la colorazione data dall’auramina;
decolorante: 0.5 ml di acido cloridrico concentrato a 100 ml di etanolo al 70%;
permanganato di potassio (colorante di contrasto): 0.5 g in 100 ml di acqua distillata.

Procedimento

Coprire totalmente il vetrino con auramina, senza riscaldare con fiamma, lasciando agire per 15 minuti;
Lavare con acqua di fonte;
Decolorare con la soluzione di acido – alcool per non più di 2 minuti;
Lavare con acqua di fonte;
Aggiungere il colorante di contrasto (permanganato di potassio) e lasciar agire per non più di 2 minuti (se lasciato agire oltre questo tempo può legarsi all’auramina mascherando la presenza di micobatteri e dando quindi dei falsi negativi);
Lavare con acqua di fonte e lasciar asciugare all’aria;
Leggere al microscopio a fluorescenza.

Osservazione del vetrino

L’osservazione e la lettura del vetrino vengono svolte al buio utilizzando un microscopio a fluorescenza, essendo questa procedura una colorazione fluorocromica. Poiché la fluorescenza decade molto facilmente ed in un tempo molto breve, la lettura dovrebbe essere svolta appena pronto il vetrino non superando mai le 24 ore. Il livello d’ingrandimento utilizzato può variare: per una migliore osservazione si può usare sia un 20x sia un 40x, prediligendo però quest’ultimo.

In presenza di micobatteri, i bacilli appariranno completamente dorati su uno sfondo del tutto nero che farà risaltare la popolazione batterica che stiamo ricercando. Tutti gli altri batteri, trattenendo il colorante di contrasto, non saranno visibili.

Figura 1 – Microscopio a fluorescenza utilizzato per l’osservazione dei vetrini

Figura 2 – Micobatteri a confronto: nella colorazione di Ziehl Neelsen (carbolfucsina a caldo) i bacilli appaiono colorati di fucsia mentre tutti gli altri batteri assorbono il secondo colorante, in genere il blu di metilene, creando uno sfondo blu

Figura 3 – in questa immagine si può vedere la netta differenza con la colorazione fluorocromica con Auramina: i micobatteri sembrano piccoli frammenti d’oro su uno sfondo totalmente nero

Priscilla Caputi