Hortaea werneckii

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Francesco Centorrino

Caratteristiche

Il micete Hortaea werneckii (chiamato anche Cladosporium werneckii, Exophiala werneckii e Phaeoannellomyces werneckii) (Fig. 1) è un lievito dematiaceo e saprofita appartenente al phylum Ascomycota, che si trova nel suolo, nel concime, nell’humus e sul legno nelle regioni tropicali e subtropicali, come America centrale e meridionale (Messico, Panama, Brasile, Argentina, Uruguay, Venezuela, Paraguay, Colombia, Costa Rica e Perù), Africa, Caraibi e Asia (India, Sri Lanka e Birmania). Si comporta come un fungo dimorfo, dal momento che nei mezzi liquidi cresce spesso con le sembianze di un lievito, anche se può passare alla crescita filamentosa; il meccanismo alla base di tale variazione non è noto.

H. werneckii al microscopio [https://www.creative-biolabs.com/drug-discovery/therapeutics/hortaea-werneckii.htm]
Figura 1 – H. werneckii al microscopio [www.creative-biolabs.com]

Questo fungo appartiene al gruppo dei lieviti neri ed è caratterizzato da una singolare tolleranza agli ambienti ad alta concentrazione salina, infatti è stato isolato da diversi habitat marini e dal suolo; la presenza di sale nel mezzo di coltura non è richiesta, tuttavia H. werneckii riesce a proliferare in soluzioni sature di cloruro di sodio (fino a 32% w/v). Considerata questa inusuale adattabilità, che lo differenzia da altri miceti alofili, H. werneckii viene descritto da alcuni autori come “estremamente alofilo”. Il meccanismo di tolleranza al sale è stato investigato a livello molecolare, e si è scoperto che i soluti maggiormente compatibili nella crescita attiva di questo micete sono il glicerolo, l’eritrolo, l’arabitolo e il mannitolo. Una diminuzione della quantità di glicerolo ed eritrolo è correlata con la severità dello shock iposmotico.

Nell’adattamento ad elevate concentrazioni saline gioca un ruolo fondamentale il gene HwHog1p, che è un omologo di HOG1 (high osmolarity glycerol) presente nel fungo Saccharomyces cerevisiae. Questo gene codifica per una proteina chinasi MAPK (mitogen-activated protein kinase), che attiva una via di segnalazione in risposta allo stress iperosmotico; l’attivazione del pathway di HOG induce la trascrizione di geni codificanti per diverse proteine, inclusi enzimi coinvolti nella sintesi del glicerolo. Il conseguente accumulo di glicerolo nel citoplasma conduce a un’incrementata osmolarità interna e ripristina il gradiente osmotico tra le cellule e il loro ambiente. L’accomodamento ad alte concentrazioni saline è accompagnato anche da cambiamenti nella composizione dei lipidi di membrana, in particolare attraverso l’aumento dei fosfolipidi insaturi; questa modificazione è mediata dall’espressione di tre enzimi, ossia Δ9-desaturasi, Δ12-desaturasi ed elongasi. Il profilo di trascrizione dei geni codificanti per questi enzimi risponde alle condizioni di salinità; l’espressione più bassa si ha a concentrazioni saline ottimali (tra 5% e 13% di NaCl).

Come abbiamo accennato all’inizio, H. werneckii è un fungo dematiaceo, ovvero distinto dalla produzione di melanina che fa apparire le cellule marroni (Fig. 2). La sintesi di melanina avviene in maniera costitutiva sotto varie condizioni saline; grazie a studi ultrastrutturali, si è visto che a concentrazioni saline ottimali (0,86 M NaCl), la melanina si accumula nella parete cellulare e forma uno strato distintivo, mentre a concentrazioni più alte la produzione melaninica si riduce. La funzione di tale pigmento è quella di consentire la ritenzione del glicerolo, non a caso se la melanizzazione è bloccata, il contenimento del glicerolo è attenuato. Tuttavia, le cellule non melanizzate compensano la bassa quantità di glicerolo con alte dosi di eritrolo e arabitolo.

La presenza di melanina nella parete cellulare può diminuire i bisogni energetici delle cellule, poiché l’accumulo di glicerolo dal mezzo di coltura, come anche la sua sintesi de novo, può essere limitata dall’effettiva ritenzione di tale soluto.

Cellule di H. werneckii; alcune appaiono scure per la presenza di melanina [https://mycology.adelaide.edu.au/descriptions/hyphomycetes/hortaea/]
Figura 2 – Cellule di H. werneckii; alcune appaiono scure per la presenza di melanina [mycology.adelaide.edu.au]

Filogenesi

Dominio              Eukaryota

Regno                  Fungi

Phylum                Ascomycota

Classe                  Dothideomycetes

Ordine                 Capnodiales

Famiglia               Teratosphaeriaceae

Genere                Horteae

Specie                  H. werneckii

Morfologia

Microscopicamente le colonie di H. werneckii sono composte da ife settate, conidi simili a quelli dei lieviti e clamidospore (spore asessuate prodotte direttamente dalle ife, con funzione di riserva); le ife e i conidi esibiscono un colore che va dal marrone all’olivaceo scuro. I conidi raffigurano le strutture iniziali che si osservano nella fase precoce dello sviluppo delle colonie, e sono formati da due cellule divise da un setto centrale, presentano una forma cilindrica o fuso, hanno un aspetto inizialmente ialino che in seguito diventa marrone pallido, con un’estremità circolare e una parte del collo affusolata e allungata (Fig. 3A e B). Il setto centrale è detto anellazione, e le cellule conidiogene vengono chiamate anellidi, i quali si restringono verso i margini e producono nuovi anelloconidi (ovvero i conidi bicellulari aventi il setto centrale).

Anelloconidi di H. werneckii colorati con lattofenolo blu di cotone. L’immagine A mostra i conidi maturi aventi una pigmentazione marrone, mentre le cellule più giovani si colorano più intensamente di blu. Un’estremità degli anelloconidi di solito è più scura, e ciò indica il punto in cui il conide era precedentemente attaccato all’anellide conidiogeno. Nell’immagine B possiamo apprezzare anelloconidi bicellulari a diversi stadi della pigmentazione con un ingrandimento maggiore [http://thunderhouse4-yuri.blogspot.com/2014/03/hortaea-werneckii.html]
Figura 3 – Anelloconidi di H. werneckii colorati con lattofenolo blu di cotone. L’immagine A mostra i conidi maturi aventi una pigmentazione marrone, mentre le cellule più giovani si colorano più intensamente di blu. Un’estremità degli anelloconidi di solito è più scura, e ciò indica il punto in cui il conide era precedentemente attaccato all’anellide conidiogeno. Nell’immagine B possiamo apprezzare anelloconidi bicellulari a diversi stadi della pigmentazione con un ingrandimento maggiore [thunderhouse4-yuri.blogspot.com]

Mano mano che lo sviluppo delle colonie prosegue, si verifica la creazione delle ife marroni (larghe fino a 6 μm), settate e dalle pareti spesse (Fig. 4).

Ife di H. werneckii colorate con lattofenolo blu di cotone. Appaiono settate e pigmentate con anellidi laterali
Figura 4 – Ife di H. werneckii colorate con lattofenolo blu di cotone. Appaiono settate e pigmentate con anellidi laterali [thunderhouse4-yuri.blogspot.com]

Al livello macroscopico le colonie di H. werneckii crescono lentamente e maturano nell’arco di ventuno giorni; al principio sono pallide, mucoidi, lucide e somiglianti al lievito, successivamente assumono un aspetto vellutato, nero-olivastro, e vengono ricoperte da un sottile strato di micelio (Fig. 5A e B).

Colonie di H. werneckii. Sia nell’immagine A che nell’immagine B si osservano delle colonie mature, data la colorazione scura e lo strato di micelio che le ricopre [https://www.creative-biolabs.com/drug-discovery/therapeutics/hortaea-werneckii.htm]
Figura 5 – Colonie di H. werneckii. Sia nell’immagine A che nell’immagine B si osservano delle colonie mature, data la colorazione scura e lo strato di micelio che le ricopre [www.creative-biolabs.com]

Patogenesi

H. werneckii è l’agente eziologico di una micosi superficiale cutanea che colpisce lo strato corneo, cioè la tinea nigra. Questo tipo di infezione si acquisisce soprattutto mediante inoculazione del fungo nella cute in seguito al contatto con il terriccio, il legno e la vegetazione in putrefazione. Poiché H. werneckii è un fungo alofilo e lipofilo, presenta una maggiore affinità per le zone della cute contraddistinte da alte concentrazioni di ghiandole eccrine, ovvero il palmo della mano e la pianta del piede. Nello strato corneo il micete sopravvive attraverso la digestione dei lipidi.

Le lesioni tipiche di questa micosi sono delle macule marroni o nere, piatte, non squamose e dai contorni irregolari; crescono celermente e il colore è dovuto alla melanina sintetizzata dal fungo (Fig. 6A e B). Hanno una certa somiglianza con il melanoma e i nevi melanocitici giunzionali (così chiamati perché la proliferazione dei melanociti avviene a livello della giunzione derma-epidermide), e per tale ragione è necessaria la diagnosi differenziale. La maggior parte degli individui con tinea nigra non ha sintomi connessi con le lesioni, anche se alcuni possono avere prurito.

Lesione caratteristica della tinea nigra, all’esame fisico (A) e all’esame dermatoscopico (B) [https://www.dermatologyadvisor.com/home/decision-support-in-medicine/dermatology/tinea-nigra-tinea-nigra-palmaris-tinea-nigra-plantaris-pityriasis-nigra-keratomycosis-nigricans-palmaris/]
Figura 6 – Lesione caratteristica della tinea nigra, all’esame fisico (A) e all’esame dermatoscopico (B) [www.dermatologyadvisor.com]

Normalmente la tinea nigra è confinata allo strato corneo, ma in situazioni alquanto rare, per esempio nei pazienti gravemente immunodepressi (precisamente quelli con neutropenia dopo trattamento per la leucemia acuta), il fungo è stato isolato dalle emocolture o dagli ascessi di organi interni. Nel caso in cui i funghi dematiacei provochino infezioni sistemiche, si parla di feoifomicosi.

All’esame istologico, mediante la colorazione ematossilina-eosina, le lesioni maculari si presentano con acantosi, ipercheratosi (anormale ispessimento dello strato corneo) e infiltrazione vascolare lieve. Applicando la colorazione istochimica dell’acido periodico di Schiff (reazione PAS), è possibile notare la presenza di ife nello strato corneo (Figura 7).

Biopsia cutanea colorata con ematossilina-eosina [https://www.dermatologyadvisor.com/home/decision-support-in-medicine/dermatology/tinea-nigra-tinea-nigra-palmaris-tinea-nigra-plantaris-pityriasis-nigra-keratomycosis-nigricans-palmaris/]
Figura 7 – Biopsia cutanea colorata con ematossilina-eosina  [www.dermatologyadvisor.com]

In un articolo del 2018, pubblicato su Revista Chilena de Pediatrìa, sono stati descritti tre casi di tinea nigra infantile. Il primo riguarda un bambino di cinque anni che aveva già avuto in precedenza una macula pigmentata sulla pianta del piede, senza sintomi, a crescita rapida. Dalla valutazione dermatologica passata era stato diagnosticato un nevo plantare, ma i genitori optarono per una seconda consultazione a causa dell’accrescimento accelerato della lesione. All’esame fisico la lesione si presentava come una macula di 2 cm di diametro, color caffè, dalla forma irregolare, i bordi definiti, senza alcun segno di infiammazione (Fig. 8). La dermatoscopia rivelò una lesione non melanocitica con multipli fili intrecciati che creavano una “rete” eterogenea (Fig. 9A). Grazie all’esame micologico si notarono numerose ife settate e pigmentate, tipiche di H. werneckii (Fig. 9B)

Macula color caffè sulla pianta del piede [Marìa Consuelo Giordano L. et al., 2018]
Figura 8 – Macula color caffè sulla pianta del piede [Marìa Consuelo Giordano L. et al., 2018]
Esame dermatoscopico (A) ed esame microscopico (B) della lesione; il primo mostra vari “fili” marroni intersecati (segno di lesione non melanocitica), nel secondo si osservano ife settate e pigmentate [Marìa Consuelo Giordano L. et al., 2018]
Figura 9 – Esame dermatoscopico (A) ed esame microscopico (B) della lesione; il primo mostra vari “fili” marroni intersecati (segno di lesione non melanocitica), nel secondo si osservano ife settate e pigmentate [Marìa Consuelo Giordano L. et al., 2018]

Il secondo caso concerne un fanciullo di tre anni che era stato ai Caraibi prima dell’inizio delle manifestazioni cliniche. Il paziente aveva una lesione sulla pianta del piede, asintomatica, che il pediatra descrisse come un “neo cresciuto” (Fig. 10). Tuttavia, l’epiluminescenza escluse la lesione nevica e l’esame microscopico svelò la presenza di ife settate.

Lesione maculare marrone chiaro sulla pianta del piede [Marìa Consuelo Giordano L. et al., 2018]
Figura 10 – Lesione maculare marrone chiaro sulla pianta del piede [Marìa Consuelo Giordano L. et al., 2018]

Il protagonista dell’ultimo caso è un bimbo della stessa età del secondo, che presentava una lesione in rapido accrescimento sul palmo della mano (Fig. 11), asintomatica, e che aveva viaggiato ai Caraibi negli ultimi sei mesi. L’analisi dermatoscopica e quella microscopica confermarono la diagnosi di tinea nigra.

Macula pigmentata sul palmo della mano [Marìa Consuelo Giordano L. et al., 2018]
Figura 11 – Macula pigmentata sul palmo della mano [Marìa Consuelo Giordano L. et al., 2018]

In tutti e tre i casi, è stato applicato il trattamento topico (con ciclopirox nel primo e nel terzo, urea e bifonazal nel secondo), che ha permesso la regressione della lesione.

Metodi di identificazione

La diagnosi della tinea nigra può essere eseguita mediante la dermatoscopia, una tecnica basata sull’impiego di un dispositivo ottico, il dermatoscopio (Fig. 12), che permette di analizzare le caratteristiche delle lesioni specifiche, non visibili ad occhio nudo, come le “fibre” attorcigliate di colore marrone (Fig. 6B). Tale peculiarità è importante per escludere tumori cutanei come il melanoma.

Esame delle lesioni cutanee mediante il dermatoscopio [https://www.uppa.it/medicina/malattie-e-disturbi/nei-e-melanoma/]
Figura 12 – Esame delle lesioni cutanee mediante il dermatoscopio [www.uppa.it]

Per confermare ulteriormente la diagnosi di tinea nigra, si utilizza l’esame microscopico rimuovendo piccole porzioni della lesione mediante raschiamento con una lama 15. Queste vengono trattate con idrossido di potassio al 20% ed esaminate al microscopio, che consente di apprezzare le ife ramificate, settate e pigmentate, e le spore (Fig. 4 e 9B). Il campione cutaneo prelevato mediante raschiamento può essere coltivato su agar Sabouraud a 25 °C; dopo una settimana si osserva la presenza di colonie nere e mucoidi.

È possibile anche l’analisi molecolare tramite la reazione a catena della DNA polimerasi (PCR).

Terapia

Di solito la tinea nigra può essere curata con farmaci a somministrazione topica. Tra questi abbiamo l’unguento di Whitfield (dal dermatologo britannico Arthur Whitfield), formato da acido salicilico (3%) e acido benzoico (6%), in una base di cera di lana o petrolato. In aggiunta a ciò, si può ricorrere ad antimicotici come il miconazolo, il chetoconazolo e il clotrimazolo, i quali agiscono inibendo gli enzimi necessari per la sintesi di steroli che compongono la membrana del micete. Ad esempio, la 14α-demetilasi, enzima chiave per la genesi dell’ergosterolo, un fosfolipide che costituisce la membrana plasmatica delle cellule fungine ma non di quelle umane.

In casi limitati, le lesioni possono essere rimosse con un bisturi 15 o mediante l’applicazione ripetuta di un nastro adesivo sull’epidermide.

Fonti

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Francesco Centorrino

Sono Francesco Centorrino e scrivo per Microbiologia Italia. Mi sono laureato a Messina in Biologia con il massimo dei voti ed attualmente lavoro come microbiologo in un laboratorio scientifico. Amo scrivere articoli inerenti alla salute, medicina, scienza, nutrizione e tanto altro.

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