La produzione biotecnologica di anticorpi policlonali e monoclonali è di fondamentale importanza sia per la ricerca biomedica, che per terapie e test diagnostici innovativi.
Gli anticorpi sono proteine prodotte dai linfociti B attivati (plasmacellule), che possono essere secrete nel plasma o posizionate sulla membrana di queste cellule. La loro funzione principale è quella di essere recettori per antigeni not self, ovvero di riconoscere macromolecole (proteine, polisaccaridi, lipidi, acidi nucleici) o piccole molecole chimiche estranee all’organismo. Grazie a questo riconoscimento, e tramite ulteriori proteine deputate alla trasduzione del segnale, si ha l’attivazione dei linfociti o di altre cellule del sistema immunitario, la neutralizzazione del microbo o tossina e la loro eliminazione.
Struttura degli anticorpi
Sono costituiti da una regione costante (C), che permette di conservarne la struttura di base e di svolgere le funzioni effettrici, e da una regione variabile (V). Questa è in genere la regione più interessante dal punto di vista biotecnologico, poiché è quella che permette di riconoscere, quindi legare, un’estrema varietà di antigeni. All’interno delle regioni V ci sono inoltre le regioni determinanti la complementarietà (CDR) che sono porzioni ipervariabili che legano l’antigene, quindi sono complementari a questo.
Sia la porzione costante che quella variabile sono presenti in ciascuna delle quattro catene polipeptidiche che formano l’anticorpo. Le quattro catene sono identiche a due a due: ci sono due catene pesanti (heavy, H) e due catene leggere (light, L). Tramite ponti disolfuro che legano tra loro una catena leggera con una pesante e le due pesanti, l’anticorpo assume la caratteristica forma a “Y”. Perciò: ogni anticorpo contiene due siti di legame per l’antigene (identici tra loro), ognuno composto dalla regione variabile della catena pesante (VH) e dalla regione variabile della catena leggera (VL).
Produzione di anticorpi: differenza tra i policlonali e monoclonali
Un antigene può contenere diversi epitopi, ovvero differenti porzioni che sono riconosciute da anticorpi necessariamente diversi. Ogni epitopo è legato da un solo tipo di anticorpo, poiché il legame è specifico e avviene per complementarietà, come tra due pezzi di un puzzle.
Per capire bene la differenza tra gli anticorpi policlonali e monoclonali è necessario prima aver chiaro che un linfocita B (e tutti i cloni che derivano da questa cellula iniziale) produce un solo tipo di anticorpo, quindi diretto verso un unico epitopo. Linfociti B differenti, invece, producono diversi anticorpi, che possono riconoscere epitopi diversi di uno stesso antigene. Di conseguenza, una popolazione monoclonale sarà costituita da cellule derivanti da un unico linfocita iniziale, e produrrà un solo tipo di anticorpo, specifico per un solo epitopo. Una popolazione policlonale sarà costituita da linfociti B differenti, che producono anticorpi diversi, diretti quindi verso più epitopi, anche se appartenenti ad uno stesso antigene.
Produzione di anticorpi policlonali
Per la produzione degli anticorpi policlonali è necessario immunizzare un animale contro l’antigene selezionato e successivamente purificare dal plasma l’anticorpo prodotto. Per la prima fase è sufficiente iniettare nell’animale l’antigene contro cui si vuole produrre l’anticorpo. L’organismo produttore viene scelto in base alla quantità di anticorpo da produrre e al tipo di antigene (maggiore è la distanza filogenica tra antigene e animale scelto, maggiore sarà la reattività del sistema immunitario contro l’antigene). In genere si utilizzano i conigli, poiché hanno un sistema immunitario molto responsivo, quindi basta una piccola quantità di antigene da iniettare. Altri animali utilizzati sono le cavie, oppure animali più grandi come le capre o pecore per avere una maggiore quantità di anticorpo.
Per migliorare la specificità dell’anticorpi, quindi la loro complementarietà per l’antigene, è bene eseguire delle immunizzazioni successive, iniettando più dosi di antigene. Questo deriva dal fatto che i linfociti subiscono diversi riarrangiamenti genici casuali durante la loro maturazione, e con il tempo sono selezionati solo quelli che riconoscono adeguatamente l’antigene.
La fase di purificazione prevede l’utilizzo di cromatografia d’affinità per prelevare dal plasma (o alternativamente dal siero) dell’animale gli anticorpi. In seguito, si avrà una miscela di anticorpi che contiene non solo quelli che riconoscono i diversi epitopi dell’antigene scelto, ma anche le immunoglobuline già presenti e proprie dell’animale, anche se in quantità estremamente inferiori. Se si vogliono ricavare esclusivamente gli anticorpi specifici per l’antigene, è necessario eseguire un’ulteriore cromatografia d’affinità, in cui si immobilizza l’antigene specifico sulla colonna. Questi sono quelli più puri, e di conseguenza aumentano tempi e costi di produzione.
Produzione di anticorpi monoclonali
La tecnica dell’ibridoma
Anche la produzione degli anticorpi monoclonali prevede una prima fase di immunizzazione dell’animale, in genere il topo. Dopodiché si procede con l’asportazione della milza, perché è da qui che vengono isolati i linfociti B maturi. Queste cellule devono essere messe in coltura per selezionare il clone che produce l’anticorpo di interesse, per poi farlo espandere e quindi replicare. Tuttavia, essendo cellule differenziate, morirebbero in poco tempo, quindi si deve creare il cosiddetto ibridoma, ovvero una cellula derivante dalla fusione di un linfocita B con una cellula di mieloma murino (tumore delle plasmacellule). La cellula tumorale serve per garantire la sopravvivenza pressoché infinita in coltura dei cloni: in questo modo si ha una cellula che secerne anticorpi (come il linfocita B) ed è immortale (come la cellula di mieloma).
Selezione dell’ibridoma
Per favorire la fusione tra le cellule si utilizza il PEG (polietilenglicole). In seguito, si avranno nella coltura vari tipi di cellule ibride: due linfociti, due cellule tumorali o l’ibridoma corretto. I primi muoiono spontaneamente, poiché non sono immortali come le cellule tumorali. Queste ultime invece avrebbero la capacità di sopravvivere, ma non nel terreno selettivo HAT che viene utilizzato per selezionare e far sopravvivere esclusivamente gli ibridomi. Infatti, in questo terreno è posto l’inibitore della diidrofolato reduttasi, l’amminopterina, che impedisce la via di sintesi de novo delle purine, necessarie per la costruzione degli acidi nucleici. La via alternativa prevede l’uso dell’ipoxantina tramite l’enzima HPGRT (ipoxantina-guanina-fosforibosil-transferasi): questa non è possibile per le cellule mielomatose perché sono deficitarie di questo enzima, mentre è sfruttabile dagli ibridomi corretti che invece lo hanno ricevuto dai linfociti B. Di conseguenza, rimarranno in vita solo gli ibridomi.
“Umanizzazione” degli anticorpi
A questo punto gli ibridomi vengono coltivati in pozzetti, in cui vengono eseguiti degli screening tramite tecniche come l’ELISA, per selezionare il clone che produce l’anticorpo d’interesse. Una volta individuato, vengono effettuate delle diluizioni successive per avere in ogni pozzetto una singola cellula, la quale viene poi fatta espandere ulteriormente. Gli anticorpi monoclonali (mAb) derivanti saranno così completamente murini.
Il loro utilizzo a livello terapeutico ha reso necessario lo sviluppo di anticorpi più umani, per aumentarne l’efficacia e soprattutto evitare una risposta anticorpale verso questi mAb in seguito alla loro iniezione. Per farlo, si può sfruttare la tecnologia del DNA ricombinante in seguito a quella dell’ibridoma, trasfettando cellule di mieloma con vettori che contengono geni murini per le regioni variabili e geni umani per le regioni costanti. Così si producono anticorpi chimerici, in cui solo le regioni variabili sono murine, oppure umanizzati, in cui solo le CDR rimangono murine, mentre tutto il resto è umano. Per avere degli anticorpi completamente umani si può applicare la tecnica dell’ibridoma su topi transgenici, in cui i geni per le immunoglobuline sono stati sostituiti da quelli umani. Infine, nei casi in cui è sufficiente avere le regioni variabili e non l’intero anticorpo, si possono produrre gli anticorpi a singola catena (scFv, single-chain variable fragment).
Applicazioni
Le applicazioni degli anticorpi sono varie, da quelle diagnostiche a quelle terapeutiche. Gli anticorpi policlonali non possono essere usati in terapia, poiché possono essere leggermente diversi in base al lotto di produzione, in più sono di origine animale. Quindi vengono usati in ricerca, nei test come Western Immunoblot, ELISA, “immuno-colorazioni”, per identificare e visualizzare la presenza di sostanze o molecole d’interesse, grazie a fluorofori coniugati all’anticorpo o altri coloranti. Oppure anche nei test diagnostici, come nei kit per identificare la presenza di SARS-CoV-2.
Gli anticorpi monoclonali sono meno usati per queste funzioni, perché più costosi e con una sensibilità (capacità di “evidenziare” l’antigene) più bassa rispetto ai policlonali, dato che i mAb si legano con un rapporto 1 a 1 all’antigene, invece più policlonali si possono legare ai diversi epitopi dell’antigene. I mAb sono quindi usati principalmente come agenti terapeutici, soprattutto contro il cancro, in cui ad esempio si possono coniugare con radioisotopi per convogliare la radioterapia direttamente sulle cellule tumorali che riconoscono e legano; possono bloccare un recettore di crescita sovraespresso sulla cellula; oppure possono attivare le cellule del sistema immunitario contro le cellule tumorali. Sono sfruttati anche nelle malattie autoimmuni, come la sclerosi multipla, in cui solitamente servono per bloccare le cellule immunitarie che agirebbero contro antigeni self.
Fonti
- Francesco Clemente, Guido Fumagalli. Farmacologia generale e molecolare – Quinta edizione. Edra. Cap. 11. ISBN 978-8821444364
- Abul K. Abbas, Andrew H. Lichtman, Shiv Pillai. Le basi dell’immunologia – Quinta edizione. Edra. Cap. 4. ISBN 9788821442551
Immagini
- Immagine in evidenzia: https://pdb101.rcsb.org/motm/21
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- Figura 2: https://pubmed.ncbi.nlm.nih.gov/20640220/
- Figura 3: creata con Canva
