Tilletia caries

Caratteristiche

Tilletia caries (o Tilletia tritici) è un fungo basidiomicete ed agente eziologico della carie del frumento. Va specificato che la malattia è causata anche da Tilletia leavis (o Tilletia foetida), che può essere trovata in consociazione con T. caries e dalla quale è difficilmente distinguibile.

La problematica maggiore di questo micete è che le spore prodotte sono molto resistenti. Questa caratteristiche gli permette di svernare sia sul materiale raccolto (semi) che nel suolo. Infatti, le spore riescono a sopravvivere nel suolo per anche 3 anni e sulle sementi conservate per diversi anni.

Un ulteriore problema è che i semi e germogli infetti sono asintomatici sino alla spigagione, anche se in alcuni casi è possibile vedere dei primi sintomi sulle foglie.

T. caries è monociclica, dato che la produzione di spore avviene solamente al momento della formazione delle cariossidi (Fig. 1). Infatti, come Ustilago nuda e Microdochium majus, Tilletia caries è considerato un patogeno che colpisce i semi. Inoltre, questa malattia colpisce prevalentemente il grano invernale per via delle condizioni climatiche necessarie per lo sviluppo del fungo.

Spiga infetta da Tilletia caries (Fonte: Cecilia Panzetti) — *Figura 1- Spiga infetta da* Tilletia caries *(Fonte: Cecilia Panzetti)*

In aggiunta, oltre ad apportare un danno quantitativo della resa di produzione, la Tilletia caries è nota per il caratteristico odore di pesce rancido dato dalla trimetilammina, il quale ne riduce la qualità del raccolto.

La riduzione della resa è dovuta sia a fattori ambientali che di cultivar. Solo una scelta errata di cultivar può portare una riduzione totale del raccolto.

Filogenesi

Regno	Funghi
Divisione	Basidiomycota
Classe	Exobasidiomycetes
Ordine	Tilletiales
Famiglia	Tilletiaceae
Genere	Tilletia
Sepcie	Tilletia caries

Tabella 1 – Filogenesi di Tilletia caries

Principali differenze tra Tilletia caries, T. controversa e T. indica

Le principali Tilletia spp. che interessano la cerealicoltura sono: Tilletia caries (o T. tritici) e T. laevis (o T. foetida), che causano la carie del frumento, T. controversa, che è la causa della carie nana del frumento, e T. indica, patogeno da quarantena e causa della carie parziale del grano.

T. caries e T. leavis possiedono un ciclo e uno sviluppo della malattia molto simili tra loro, come pure le spore e sono difficili da distingue tra loro per via morfologica.

Invece, la biologia di T. controversa è più simile a quella di T. indica. Inoltre, è stato provato che T. controversa, T. caries e T. foetida sono varianti di una singola specie.

La prima differenza tra le varie specie si evidenzia quando la teliospora germina, producendo un basidio. Quest’ultimo sviluppa un numero specifico di basidiospore che identificano la specie.

Una seconda differenza si evidenzia poi attraverso il riconoscimento morfologico delle spore, che hanno un diametro e colorazioni differenti, e lunghezza della guaina gelatinosa ialina echinulata specifica per la specie.

Inoltre, queste basidiospore sono ben distinguibili da altre spore presenti sul materiale infetto per via sia della tipica forma, quasi, perfettamente sferica che della caratteristica l’esospora è reticolata, con areole poligonali relativamente grandi e regolari.

T. caries e T. laevis producono da 8 a 16 basidiospore. Le teliospore hanno una diametro di 16-20 µm (range di 14-25 µm), con colorazione da giallo pallida a marrone rossastro. Le “spine” che circondano l’esospora misurano 0,5-1,5 µm. La permanenza delle spore nel suolo è di 3 anni.
T. controversa produce da 14 a 30 basidiospore. Le teliospore variano da giallo-brunastro al rosso-bruno e diventano più scure raggiunta la maturità. Solitamente le spore hanno un diametro di 19-24 µm, ma il range è di 17-32 µm. Le spore mature sono tipicamente circondate da una guaina gelatinosa ialina, simile a delle spine, spessa di 1,5-5,5 µm (Fig. 2). Questa caratteristica la rende ben distinguibile dalle altre Tilletia spp. La resistenza media delle spore nel suolo è di 10 anni.
T. indica ha una produzione da 32 a 128 basidiospore. Le spore mature sono bruno scure e il diametro medio è di 35 µm. Le areole del reticolo dell’esospora sono solitamente irregolari o subcerebriformi; questa caratteristica può portare a confondere le spore di T. indica con quelle di T. controversa non ancora mature che occasionalmente presentano questa morfologia. La vita media delle teliospore nel terreno è di 5 anni.

Spora di Tilletia controversa — *Figura 2 – Spora di* Tilletia controversa *(Fonte: Cecilia Panzetti)*

Genoma e metabolismo

È stato ipotizzato che per dare avvio all’infezione da Tilletia caries sia necessario un cambiamento dell’equilibrio fitormonale del grano. Infatti, sembrerebbe che questa variazione sia necessaria per la penetrazione e la localizzazione del fungo nei tessuti delle piante e per la formazione di interazioni compatibili tra il patogeno e la pianta.

I ricercatori hanno osservato che nella crescita dei germogli e di calli di grano infettati da spore di Tilletia caries, sia in vivo che in vitro con e senza fitormoni, la crescita delle piante avveniva normalmente. Questo significa che il patogeno produce un ormone simile al fitormone della crescita prodotto dalla pianta.

Infatti, nella fase di penetrazione del fungo si osserva un accumulo di acido indol-3-acetico (IAA) nell’ospite. Successivamente è possibile osservarne una riduzione ad un livello controllato, fino a un passaggio dell’equilibrio dei fitormoni verso le citochinine.

Inoltre, è stato osservato che la carica superficiale netta, l’idrofobicità e la struttura delle molecole della superficie della parete cellulare sia della pianta che della spora giocano un ruolo molto importante nell’interazione ospite-patogeno.

Immagini al microscopio

Le spore (Fig.3) possono avere una forma da globose a subglobose, con un diametro da 14-25 µm. Il colore è solitamente giallo pallido-marrone rossastro con la parte interna più chiara rispetto a quella esterna.

L’esospora è ornata da un reticolo poligonale, con areole regolari alte 1,5-3 µm e con un diametro di 3,5 µm. Inoltre, la parte esterna è circondata da creste larghe 2,5 µm e alte 0,5-1,5 µm.

Spora di Tilletia caries (Fonte: Cecilia Panzetti) — *Figura 3 – Spora di* Tilletia caries (Fonte: Cecilia Panzetti)

Spesso durante l’analisi del materiale infetto sono presenti altre spore, solitamente Epicoccum spp., facilmente distinguibili dato che le teliospore di T. caries sono solitamente di forma regolare circolare ed è possibile vedere il reticolo.

Morfologia della colonia

La crescita di spore di Tilletia caries in vitro è abbastanza complessa, seppure questo sia possibile sia in soluzioni acquose che su potato dextrose agar (PDA) che su altri substrati.

Infatti, su terreno a base di frumento, si può osservare la fase patogena a 15-18°C con produzione massiccia di teliospore. Queste colonie presentano ife spesse, contorte, altamente ramificate, con cellule corte e con solitamente uno o due nuclei per cellula.

A temperature più calde o su un terreno chimicamente definito, le colonie non sono più teliosporogene, ma diventano colonie aploidi mononucleate. Le ife sono aploidi mononucleate più sottili rispetto alle diploidi, dritte, lunghe e non contengono mai più di un nucleo per cellula.

Metodi di identificazione

Il principale metodo di identificazione della Tilletia caries è il riconoscimento dei sintomi sia in campo che in serra. In particolare, sono osservabili sulle foglie (primi sintomi) e dalla colorazione della spiga non ancora matura; un riconoscimento certo è al momento della maturazione del cereale.

I sintomi fogliari (Fig. 4) sono caratterizzati da piccole macchie clorotiche disposte lungo una linea, ma possono essere fuorvianti. Infatti, possono avere altre cause come danni fisici o infezioni da altri patogeni i quali non vengono catturati o sono poco visibili e dei quali di conseguenza non è possibile identificare l’infezione. Inoltre, alcuni studiosi hanno riscontrato che in alcune cultivar resistenti possono manifestarsi i sintomi fogliari, ma non l’infezione a livello di spiga e di conseguenza non essere dannose per la pianta. Quindi, questi sintomi possono essere fuorvianti.

Sintomi fogliari causati da infezione di Tilletia caries (Fonte: Cecilia Panzetti) — *Figura 4 – Sintomi fogliari causati da infezione di* Tilletia caries *(Fonte: Cecilia Panzetti)*

I sintomi all’emergenza delle spiga sono caratterizzati dalla foglia a bandiera che presenta striature gialle. La pianta può diventare stentata, la spiga tozza e di colore grigio scuro-blu-verde.

Durante la maturazione le glume si aprono leggermente mostrando la cariosside completamente sostituita da ammassi di spore. Questi sori contengono milioni di spore oleose, dal colore bruno-nero e con il caratteristico odore di pesce rancido che, nei casi più gravi, si estende a tutto il campo. Talvolta le piante malate possono essere stentate; in caso di cultivar resistenti o di una lieve infezione le glume possono presentarsi chiuse ed è necessaria un’apertura manuale della spiga per poter vedere i sintomi (Fig. 5). Il sintomo di infezione certa rimane, quindi, la formazione di sori nella spiga.

Spighe di cultivar poco suscettibile. A sinistra spiga sana, a destra spiga infetta da Tilletia caries e rispettivo dettaglio dei semi. (Fonte: Cecilia Panzetti) — *Figura 5 – Spighe di cultivar poco suscettibile. A sinistra spiga sana, a destra spiga infetta da* Tilletia caries e rispettivo dettaglio dei semi. (Fonte: Cecilia Panzetti)

Per identificare la presenza delle spore di Tilletia spp. sul materiale raccolto è necessario effettuare lavaggi con soluzione salina di un determinato numero di semi (che varia a seconda della specie). Dopo che la soluzione contente i campioni è stata agitata è necessario filtrarla utilizzando filtri da 5 µm. Quando tutto il liquido è stato filtrato il filtro viene osservato al microscopio 40x. Il filtro viene suddiviso in 10 zone, nelle quali vengono contate il numero di spore presenti e successivamente viene stimata la quantità di teliospore per chicco di grano. Il riconoscimento della specie viene effettuato in maniera morfologica utilizzando o la lente 20x o altri tipi di microscopi. Quando l’ammontare delle spore è molto elevato è possibile sospenderle su un altro vetrino.

Per l’identificazione molecolare della specie possono essere sequenziate dopo la germinazione delle spore su substrati di crescita. Nel caso del PDA è consigliato mantenere la colonia a 18°C per 5 giorni, anche se alcuni ricercatori consigliano 10 gironi. Ad oggi per Tilletia caries, T. leavis e T. controversa è però difficile trovare primer specifici per il riconoscimento molecolare.

Ecologia

La germinazione delle teliospore e l’infezione dei germogli di frumento è influenzata dall’umidità del suolo e dalla temperatura.

In particolare, l’ingresso da parte di Tilletia caries dipende dalla temperatura e dell’umidità nelle prime due settimane dopo la semina. In generale, grazie a diversi studi sia in campo che in serra, si può dire che le temperature tra 4 e 16°C favoriscono la germinazione delle teliospore e l’umidità del suolo favorisce la germinazione sia dei semi che spore.

Pertanto, per il grano invernale, l’infezione è favorita quando il seme viene piantato tardivamente, e cioè quando le temperature del suolo sono più fresche.

Dato questo rapporto con le condizioni metereologiche, si possono registrare grandi differenze di insorgenza della malattia tra le annate dei raccolti. Questa differenza è dovuta anche alla presenza di diversi geni di virulenza all’interno della popolazione patogena.

Alcuni studi hanno anche osservato come il substrato, l’ingestione da parte degli animali e dalla provenienza dell’inoculo possano influenzare la sopravvivenza e la patogenicità delle spore nel tempo.

Da queste ricerche è emerso che la vita delle spore è significativamente maggiore nel caso di terreni sabbiosi rispetto a quelli argillosi. Nel caso dell’inoculo, l’infezione avviene più facilmente se le spore sono a contatto con i semi rispetto al substrato di crescita.

Invece, nel caso dell’infettività delle spore transitate attraverso il tratto digestivo degli animali, è stato osservato che varia a seconda della specie di questi ultimi. Nel caso di bovini e ovini l’infettività rimane -rimanendo, quindi, nel letame-, ma nei suini e nel pollame avviene una riduzione.

Patogenesi

Le spore di Tilletia caries possono svernare sia nel suolo che sul materiale raccolto e stoccato. L’infezione ha inizio al momento della germinazione del seme: la spora produce un’ifa che infetta il germoglio e, in maniera intercellulare, si stabilisce nel meristema apicale e si mantiene in maniera sistematica all’interno della pianta.

La germinazione delle teliospore avviene con condizioni ambientali favorevoli e contemporaneamente a quella del seme. Ogni spora produce un breve tubo germinale, tecnicamente chiamato basidio, poco dopo la sua formazione produrrà quattro – o più – spore filiformi di colore chiaro, aploidi. Detti sporidi primari o basidiospore.

Successivamente gli sporidi, geneticamente compatibili, fanno anastomosi (fusioni) formando una struttura ad H che permette ai nuclei aploidi nei due sporidi di unirsi come un dicarion.

Questa ifa dicariotica penetra nel tessuto del germoglio e si stabilisce appena dietro il punto di crescita, per poi stabilirsi nel meristema apicale. Questo è il punto cruciale dell’infezione: il fungo deve raggiungere il meristema apicale prima che l’estensione dell’internodo sposti l’apice troppo in alto. Infatti, grazie alle temperature fresche la crescita del germoglio è rallentata e l’infezione è agevolata.

Dopo l’infezione iniziale, le ife sono inizialmente scarse nella pianta, per poi proliferare negli apici quando iniziano a formarsi gli ovari.

Successivamente avviene la sporulazione nel tessuto dell’endosperma fino alla conversione totale del seme in un soro costituito da una massa di teliospore ricoperte da un periderma modificato, dall’aspetto sottile e simile alla carta, con colore che varia da marrone scuro a nero.

In poche parole, durante la formazione della spiga di grano, le ife del fungo invadono il seme appena sviluppato e cominciano a proliferare rapidamente, sostituendo le cellule del seme e mantenendo solo lo strato esterno. Dopo di che le singole cellule del fungo si “arrotondano” formando teliospore. Al loro interno i due nuclei, che erano presenti nelle ife, si fonderanno per formare un unico nucleo diploide (Fig. 6).

La diffusione delle spore avviene prevalentemente durante la raccolta. Infatti, le spore vengono rilasciate dalle spighe infette nel momento in cui il grano attraversa la mietitrebbia. Ciò agevola anche la diffusione delle spore in altri campi e nel suolo. Altre via di propagazione sono date dal vento e dalla pioggia. Le spore o le cariossidi infette sulla superfice del suolo possono essere incorporate nel terreno durante i processi di coltivazione.

Ciclo vitale Tilletia caries (Fonte: Cecilia Panzetti) — *Figura 6 – Ciclo vitale* Tilletia caries (Fonte: Cecilia Panzetti)

Terapia

Per evitare la carie del frumento è necessario utilizzare sementi sane e certificate. I semi possono essere trattati con sostanze chimiche di sintesi, fungicidi di contatto, che colpiscono la germinazione delle teliospore sulla superficie del seme, come ad esempio il Vitavax®.

Soluzioni alternative sono i trattamenti fisici come lo “spazzolamento” dei semi in combinazione oppure singolarmente con la pulizia ad aria compressa, il vapore o la combinazione tra vapore e ultrasuoni (Sonosteam). Altre soluzioni biologiche sono ad esempio Tillecur® (con mostarda) e Cerall® (con Pseudomonas chlororaphis). Ovviamente la ricerca per queste soluzioni non si ferma e le costanti sperimentazioni potranno allungare lista dei prodotti efficaci contro questo fungo. Infatti alcuni studiosi hanno osservato l’efficacia di prodotti derivati dal latte, di trattamenti con soluzioni di acido acetico (sia liquido che in vapore), batteri (Bacillus spp. e Streptomyces spp.), collemboli, inibitori dei ferormoni dell’accoppiamento e composti organici volatili prodotti da Muscodor albus.

Inoltre, è consigliato effettuare il trattamento delle sementi seguendo delle soglie di infezioni. Le quali variano a seconda del Paese, dell’utilizzo delle sementi e della suscettibilità delle cultivar.

Le soluzioni alternative a quelle chimiche di sintesi sono molto richieste dall’agricoltura moderna, che è costantemente alla ricerca di metodi di controllo più sostenibili che evitino costi aggiuntivi. In questo contesto, in passato l’interesse si è concentrato sulla ricerca nel breeding delle piante, che ha identificato una serie di geni di resistenza e QTL, che non conferiscono necessariamente una resistenza totale. Tuttavia, poco si sa quanto questi geni siano coinvolti nel ciclo della malattia.

Infatti, a seconda di quando vengono attivati, essi possono funzionare diversamente. Ad esempio, se fossero attivati durante la fase di penetrazione, bloccherebbero l’infezione attraverso la cuticola. Invece altri meccanismi agiscono successivamente nello sviluppo della pianta, come il fatto di impedire la crescita del micelio nelle ovaie. Il problema è che questi ultimi, attivandosi tardivamente, possono far sì che la pianta si infetti effettivamente all’inizio e presenti sintomi clorotici sulle foglie (dando falsi positivi nel rilevamento del patogeno), ma la resistenza impedirà lo sviluppo di sori e spore nella spiga (solitamente sono coinvolti i geni bt8, bt9 e bt10).

Invece, per quanto riguarda le pratiche agronomiche, dato che l’infezione avviene con temperature fresche del suolo è consigliata la semina precoce per il grano invernale e la semina tardiva per il grano primaverile. Inoltre, è consigliata una buona gestione irrigua del campo, dato che un’alta umidità del suolo agevola l’infezione.