La produzione ricombinante: utilizzo degli organismi come “cell factories”

Le biotecnologie, ed in particolare le tecniche del DNA ricombinante (Fig. 1), ci permettono di riprogrammare le cellule e sfruttarle per scopi ben definiti. Ad oggi, grazie agli organismi ingegnerizzati, definiti con il tanto temuto termine di OGM, è possibile produrre molecole fondamentali, di interesse medico, ambientale e industriale.

Introduzione alla produzione ricombinante

Moltissime specie batteriche, così come specifici tipi di cellule eucariotiche, possono essere utilizzate come delle mini-fabbriche per produrre, in grandi quantità, molecole provenienti da altri organismi. Si tratta di farmaci, vaccini di seconda generazione, antitumorali, interferoni, anticorpi monoclonali o molecole di interesse ambientale. Nel mondo biotech si parla, in generale, di molecole ad alto valore aggiunto, prodotte grazie alle cell factories.

Molto spesso, queste molecole sono di natura proteica e la loro produzione viene definita ricombinante. Il termine deriva dall’utilizzo di specifiche tecniche, definite tecniche del DNA ricombinante, basate sull’utilizzo di enzimi di restrizione. Si tratta di nucleasi che riescono a tagliare il DNA in siti specifici, generando frammenti che possono essere combinanti e uniti tra loro in maniera diversa.

La produzione ricombinante avviene principalmente per ottenere grandi quantità di una stessa proteina, in relazione a quello che sarà il suo uso finale:

• se la molecola è usata livello terapeutico deve essere prodotta su larga scala. Grazie alle cell factories è possibile massimizzare la qualità, diminuire il più possibile i costi e ridurre i rischi collegati ai classici metodi di sintesi/estrazione;
• se la molecola è impiegata in esperimenti di ricerca di base. In questo modo si ha la possibilità di studiare e definire la sua struttura e di capire le sue proprietà funzionali;
• se la molecola corrisponde al target di nuovi farmaci in via di sviluppo. Anche in questo caso, avere una grande quantità della proteina ricombinante permette di analizzare nel dettaglio le modalità di azione;
• se la molecola è un enzima commerciale. La produzione ricombinante permette infatti di ottenerne in quantità elevatissime e a costi relativamente bassi, le caratteristiche ideali per l’ambiente industriale.

Questi sono solo alcuni esempi dei possibili impieghi delle proteine ricombinanti. Il punto di partenza per la loro produzione è, in ogni caso, l’ingegnerizzazione delle cellule.

Fasi del processo produttivo

La produzione ricombinante (Fig. 2) può avvenire grazie alla modifica del genoma e delle capacità metaboliche delle cellule.

Prima di tutto bisogna isolare e identificare il gene di interesse, quello codificante la proteina da produrre. A partire dal genoma di riferimento, tramite diversi approcci, come PCR e confronto di database, costruzione di librerie o shot-gun, la sequenza genica può essere facilmente individuata.                                                                   

Successivamente, si possono applicare tecniche di mutagenesi sulla sequenza stessa. Ad esempio, si può modificare la successione di codoni in modo tale da avere quelli maggiormente riconosciuti dalla cellula ospite (codon usage). Oppure si può aumentare l’espressione del gene lavorando sulla forza del suo promotore o sugli eventuali sistemi di regolazione presenti. Lo scopo di queste modifiche sarà quello di migliorare la produzione finale, massimizzando il più possibile le rese.

Allo stesso modo, una volta scelto, anche il sistema di espressione deve essere analizzato e perfezionato. In questo senso si può agire sia sul vettore e sulle sue componenti, sia sulle cellule, dal punto di vista dell’ingegnerizzazione e della crescita. In generale, la proteina ricombinante che si ottiene dovrebbe condividere con la proteina primaria: sequenza amminoacidica, struttura tridimensionale e attività biologica, soprattutto nel caso venga prodotta a scopi terapeutici.

Una volta ottenuta la produzione, la proteina ricombinante dovrà essere testata per le caratteristiche ricercate ed infine recuperata e purificata dal sistema di espressione tramite una serie di processi downstream che prendono avvio con la lisi delle cellule.

Sistemi di espressione

Il sistema di espressione corrisponde alla combinazione della cellula ospite usata e di un apposito vettore, che deve essere in grado di veicolare il gene scelto, consentendone l’espressione ad alti livelli.

I sistemi di espressione utilizzabili sono: cellule microbiche procariotiche, cellule microbiche eucariotiche, cellule vegetali, cellule di insetto e cellule di mammifero.

La scelta di uno di questi deve prendere in considerazione diversi fattori:

• le dimensioni e le caratteristiche della proteina d’interesse, ma anche la localizzazione. Ad esempio, se la proteina che si vuole produrre è una proteina dii membrana difficilmente si sceglierà di utilizzare Escherichia coli;
• il livello di espressione desiderato, che può andare da μg (necessità terapeutiche) a kg (necessità industriali);
• l’attività biologica della proteina collegata alla finalità di utilizzo. Se si vuole utilizzare come biofarmaco, l’attività biologica della proteina è importante e questa è spesso correlata ad una certa modificazione, e quindi bisogna usare sistemi di espressione adeguati. Se, invece, si vuole utilizzare la proteina per produrre anticorpi, la funzione non è importante e quindi la presenza della modificazione non è necessaria;
• i costi di produzione, collegati anche questi all’utilizzo finale della proteina.

I vettori

La sequenza codificante la proteina, isolata da una cellula X, deve essere inserita in un vettore appropriato, per far sì che il gene si esprima o si integri in maniera corretta all’interno del nuovo ospite.

Il vettore (Fig. 3) e le metodologie con cui questo è inserito all’interno delle cellule vengono scelti in base al sistema di espressione considerato. I vettori corrispondono generalmente a plasmidi, facilmente manipolabili e mantenuti nelle cellule con un elevato numero di copie.

In altri casi, possono essere utilizzati i vettori virali, che si avvalgono dell’utilizzo di virus appositamente ingegnerizzati per trasportare il gene di interesse senza però risultare virulenti. I vettori virali sono delle scelte obbligate nel caso in cui la produzione debba avvenire in cellule di insetto, che devono essere ingegnerizzate tramite Baculovirus.

Indipendentemente dalla loro natura, di solito i vettori contengono:

• una o più ori (origine di replicazione), compatibile con la cellula produttrice,
• uno o più marker di selezione, solitamente resistenza ad antibiotici, che permette di selezionare le cellule che mantengono il vettore,
• una regione MCS (Multiple Cloning Site), dove inserire il gene di interesse attraverso l’utilizzo di nucleasi di restrizione.

La sequenza codificante la proteina di interesse viene inserita all’interno del vettore e posta sotto il controllo di un promotore, generalmente forte, e un terminatore. La presenza di queste sequenze è fondamentale, poiché ne assicura la trascrizione e quindi l’espressione.

Sistemi di espressione a confronto: procarioti vs. eucarioti

I sistemi di espressione utilizzabili sono caratterizzati da vantaggi e svantaggi, che devono essere presi in considerazione quando si decide di mettere in atto una produzione ricombinante.

In generale, si può dire che i microrganismi sono facilmente manipolabili, economici e modificabili in tempi rapidi. Tuttavia, le proteine prodotte nei batteri sono prive di modificazioni post-traduzionali. Come già detto, queste modificazioni, soprattutto nel caso di proteine eucariotiche, risultano fondamentali per la corretta funzionalità della molecola.

I sistemi di espressione eucariotici consentono invece di ottenere le glicosilazioni, ma queste sono spesso specie-specifiche e comunque differenti rispetto quelle endogene. Tra i sistemi di espressione eucariotici ci sono i lieviti Saccharomyces cerevisiae e Pichia pastoris, ma anche cellule di insetto e cellule di mammifero. S. cerevisiae è sicuramente il sistema di espressione eucariotico più usato, poiché è facilmente applicabile a livello industriale e ha tools e vettori già ampiamente consolidati. Inoltre, il lievito permette la secrezione della proteina di interesse e quindi un recupero più semplice ed è considerato in generale un sistema safe.

Infine, le coltivazione di cellule di mammifero è lenta, costosa e difficilmente consente l’ottenimento di proteine in alta resa. Allo stesso tempo, questo sistema di espressione permette l’ottenimento di proteine eucariotiche che rispecchiano completamente le caratteristiche di quelle endogene.

Esempio: produzione ricombinante di somatotropina

Il primo farmaco biotecnologico, prodotto per via ricombinate e immesso sul mercato sotto il nome di Humulin nel 1982, è stato l’insulina. Analogamente, dopo il 1985 è iniziata la produzione di un altro ormone, l’hGH.

L’ormone della crescita, o somatropina (Fig. 4), è un ormone di origine proteica, normalmente secreto dal lobo anteriore dell’ipofisi, che risulta indispensabile per la crescita e il normale sviluppo dell’organismo.

Questa molecola è in grado di stimolare l’accrescimento scheletrico e somatico e influenza moltissimi aspetti del metabolismo regolando la lipolisi, la sintesi proteica e il metabolismo dei carboidrati. L’hGH è importantissimo poiché associato nei bambini a forme di nanismo o di gigantismo e ad alcune forme di diabete. Mentre, una sua disfunzione negli adulti può determinare disturbi cardiovascolari o acroamegalia. In passato, la somatotropina veniva ottenuta tramite l’estrazione da ipofisi di cadaveri (umani o di scimmia) e, per la somministrazione nell’arco di 10 anni su un singolo paziente, erano necessarie circa 80 ipofisi.

Per via di questi numeri molto elevati e per il livello di sicurezza molto basso, nel 1985 questa forma di hGH viene eliminata dal mercato, erano infatti molto frequenti infezioni da parte di virus o lo sviluppo di patologie associate. Si è scelto, quindi, di produrre la molecola per via ricombinante, utilizzando cellule di E.coli. La somatropina ricombinante prende il nome di rhGH ed è contenuta in farmaci come il Genotropin (Pfizer).

Fonti

• Donadio, S. “Biotecnologie microbiche.” CEA (2008)
• Wilson, K., and J. Walker. “Biochimica e biologia molecolare. Principi e tecniche.” Raffaello Cortina Editore (2006)
• Somatropina (humanitas.it)
• 11 Diseases CRISPR Technology Could Cure! – Nuclineers
• Healthcare Biotech Innovation (wordpress.com)
• Global Human Somatotropin Market 2021-28 vigorous growth: AnkeBio Co. Ltd, Eli Lilly and Company, Ferring BV – The Courier (mccourier.com)