Taq dna Polimerasi: la rivoluzione della biologia molecolare

Le DNA Polimerasi sono enzimi che catalizzano reazioni essenziali per la vita ovvero la replicazione e la riparazione del DNA. Questi enzimi catalizzano la sintesi del DNA a partire dai suoi “mattoni” che sono i nucleotidi. I nucleotidi vengono incorporati man mano in un filamento di DNA nascente complementare a un filamento di DNA stampo. Questa capacità rende le DNA polimerasi uno dei cavalli di battaglia per la biologia molecolare e le biotecnologie. In particolare, la DNA polimerasi termostabile (Taq) sarà oggetto di questo articolo.

Cosa è Taq Polimerasi?

La Taq polimerasi, una delle prime DNA polimerasi termostabili ad essere scoperta, si classifica come una DNA polimerasi DNA-dipendente. L’enzima è costituito da una singola catena polipeptidica con un peso molecolare di circa 94 kDa e ha un optimum di attività replicativa del DNA a 72 °C. E’ stata isolata per la prima volta nel 1976 dal batterio termofilo chiamato Thermus aquaticus che vive in ambienti a temperature estremamente elevate come le sorgenti termali. Infatti la Taq polimerasi è un enzima termostabile che non si degrada alle alte temperature, a differenza della DNA polimerasi. Proprio per la sua capacità di tollerare alte temperature, la Taq polimerasi è l’enzima più utilizzato per sintetizzare il DNA o il gene di interesse in vitro mediante la tecnica PCR. Quando la Taq polimerasi fu isolata, nessuno poteva immaginare l’impatto che l’applicazione della Taq polimerasi avrebbe avuto sulla biologia molecolare.

PCR

La PCR è l’acronimo di reazione a catena della polimerasi ed è una tecnica che permette di amplificare, in modo estremamente selettivo, un tratto definito di DNA. Amplificare significa ottenere numerose copie di un tratto di DNA di nostro interesse. Questa tecnica è sostanzialmente una riproduzione in vitro di ciò che avviene in vivo.

Quali sono gli ingredienti necessari per fare una PCR? Oltre al DNA target, il tratto da “copiare”, devono esserci:

la Taq polimerasi, che è l’enzima chiave di questo processo;
i quattro deossinucleotidi trifosfato (dATP, dTTP, dCTP, dGTP ovvero “l’alfabeto del DNA”);
due primer (gli “inneschi” dai quali la polimerasi inizia la reazione di polimerizzazione). I primer sono corte sequenze di DNA a singolo filamento e sono complementari uno all’estremità 3′ e l’altro all’estremità 5’del segmento di DNA che si vuole amplificare. La loro particolarità consiste nell’avere un 3′ OH libero al quale la polimerasi andrà ad aggiungere via via dei nucleotidi secondo la complementarità delle basi;
MgCl₂, indispensabile per il corretto funzionamento della DNA polimerasi;
TrisHCl (soluzione tampone in cui la DNA polimerasi funzioni. La DNA polimerasi funziona solo in un determinato range di pH che deve essere costante).

Le fasi della PCR

La PCR è una reazione ciclica costituita da 25-35 cicli ciascuno costituito da tre passaggi successivi:

*Figura 1-Tre fasi della PCR* [ Fonte: researchgate.net]

Denaturazione del DNA(1): la prima fase consiste nella separazione dei due filamenti di DNA ad una temperatura di 94°-95°C.
Annealing (2): successivamente la temperatura viene abbassata fino a 50-60 °C circa al fine di permettere il legame dei primer alle regioni complementari dei filamenti di DNA denaturati.
Polimerizzazione(3): Entra in gioco la Taq polimerasi, il “playmaker” della reazione. In questo ultimo step, la temperatura si innalza a 72°C al fine di massimizzare l’azione della Taq polimerasi. L’enzima sintetizzerà un neofilamento, complementare a quello usato come stampo aggiungendo i deossinucleotidi trifosfato. Nel dettaglio la Taq polimerasi catalizza il legame fosfodiesterico tra il terminale 3’OH del nucleotide precedente e il gruppo fosfato sul 5′ di un nuovo nucleotide. L’aggiunta dei nucleotidi richiede ovviamente energia che forniscono i nucleotidi stessi. Nella reazione i nucleosidi trifosfato liberano l’energia sufficiente per la formazione del legame fosfodiesterico in seguito alla rottura del legame ad alta energia esistente tra il primo fosfato e gli altri due. La successiva idrolisi del gruppo Pi-Pi (pirofosfato) rende la reazione irreversibile iniziando così la reazione a catena della polimerasi.

*Figura 2-Formazione del legame fosfodiesterico* *[Fonte:chimica-online.it]*

Questo processo viene ripetuto più volte per creare milioni di copie di DNA. Dopo il primo ciclo da una singola molecola di DNA se ne originano 2, dopo il secondo ciclo da queste se ne originano 4, e così via.
L’intera procedura dura solo pochi minuti e per essere realizzata si utilizza un termociclatore, ovvero uno strumento in grado di programmare nel tempo, in modo automatico, la temperatura.

Qual è la particolarità della Taq dna polimerasi?

All’inizio esisteva un problema ovvero i requisiti termici. Infatti per denaturare il DNA bisogna scaldarlo a più di 90 °C, una temperatura che risultava incompatibile con la DNA polimerasi umana, che veniva distrutta. Se però fosse stato necessario aggiungere l’enzima dopo ogni ciclo, la PCR sarebbe stata impraticabile. Per ovviare a questo inconveniente si fa ricorso alla Taq polimerasi che non si inattiva grazie alla sua capacità di resistere alle alte temperature. Ciò consente di realizzare più cicli di PCR eliminando così la necessità di aggiungere nuovi enzimi dopo ogni ciclo. Quindi l’uso della polimerasi consente non solo di effettuare la fase di estensione a 72°C ma anche di aumentare la resa e la specificità dei prodotti di reazione e soprattutto ha reso possibile l’automatizzazione del processo. Grazie a queste proprietà, la PCR diventa una tecnica di laboratorio eseguita di routine che ha portato a un vasto progresso nella scienza.