Melipona: api senza pungiglione. I loro nuovi probiotici

Millenni sono trascorsi, ormai, da che le api sono assurte, per l’uomo, a modello dell’industrioso, senza requie, nè clamore. E Melipona è proprio il genere archetipico, di questa minuta alacrità. Api senza pungiglione, etimologicamente affaccendate nel miele, dal promettente vivaio microbiotico addominale, fatto di LAB, batteri acido lattici. Se è vero che i viventi più cospicui, su questo stanco pianeta, siano i batteri e che, invece, tra gli animali, gli insetti la facciano da padroni, il nobile connubio racchiude già in sè il germe della nostra conservazione.

Nell’ultimo studio, l’isolamento e la caratterizzazione dei batteri lattici, delle api senza pungiglione, si è svolto su esemplari del Borneo del Nord, anzi di una regione particolare: il Sabah.

Sabah, negeri di bawah bayu

Il Sabah, negeri di bawah bayu, “la terra sotto il vento“, è uno dei due territori federali della Malaysia, nel Borneo. Geograficamente esposto ai tifoni. La costa del Sabah (figura 1) si diparte dalla baia del Brunei, formando una penisola maestosa, che si specchia in un’isoletta antistante, Labuan, dagli indimenticabili toni salgariani. Ad oriente, invece, il litorale è costellato di insenature, le baie di Labuk, Sandakan, Darvel. A sud di Darvel, solo scogli corallini. Tutto, lambìto dal turchese con riflessi verde giada, che trasfonde nel blu, profondo.

La regione del Sabah, nel Nord Borneo è una delle zone naturali d'origine delle api senza pungiglione. Il genere Melipona che promette, nello studio appena pubblicato, nuovi ceppi probiotici di batteri lattici. — *Figura 1 – Sabah, Borneo del Nord, tra le regioni d’origine del genere Melipona, di api senza pungiglione e altamente mellifere. Fonte [tripsavvy].*

Il clima è caldo-umido, ed i crinali sono ammantati interamente di fitte foreste sempreverdi, i cui legni, pregiati, sono anche ampiamente commercializzati e che, soprattutto, ospitano straordinarie ed eclettiche architetture di fango e resine. Il geopropolis delle api Melipona. Con tanto di mandaçaia, meravigliosa guardia, (figura 2) a piantonare, quello che si fatica a definire solo un alveare. In uno degli angoli più selvaggi di questo immenso paradiso terracqueo.

Le api senza pungiglione, che promettono nuovi batteri, hanno alveari vigilati dalla Mandaçaia, una operaia guardiana. — *Figura 2 – Mandaçaia, meravigliosa guardia, all’imbocco dell’alveare. Fonte [lareconexionmexico].*

Lo stato sociale delle api senza pungiglione

Li altri giron per varie differenze
le distinzion che dentro da sé hanno
dispongono a lor fini e lor semenze.  
                                                                                                         Paradiso II, 118-120

Spettacolare architettura d'alveare, caratteristica delle api senza pungiglione, #Melipona, che racchiudono in sè i nostri prossimi #batteri #probiotici. — *Figura 3 – Alveare di api senza pungiglione. Fonte [Inhabitat]*

Invece, nonostante le apparenze, questa dantesca struttura ascensionale non separa le caste, le semenze: le integra. Al centro, infatti, della complessa collina si trovano, in sviluppo orizzontale, i favi da covata, con le larve. Esse, diversamente dall’Apis mellifera, non sono nutrite direttamente, ma le si lascia, in cella, con polline e nettare. Quindi, nelle minuscole canne d’organo ambrate, l’uovo deposto viene sigillato, insieme alle sue belle scorte di nutrienti. Come una sacra sepoltura, prenatale. Il tempo trascorre e guida la pupazione. Quando lo sviluppo è giunto a compimento, le api, che saranno giovani operaie, emergeranno, come risorte, dalle loro celle; pur rimanendo nell’alveare, a disposizione delle infinite attività e necessità della comunità. Che può arrivare a contare fino ad 80’000 individui (figura 3).

Sempre per differenza, rispetto all’Apis mellifera, le femmine saranno regine od operaie, in funzione della quantità di nutrimento assunto durante la crescita; con anche una determinante componente genetica, certo. Il 5-14% delle femmine, infatti, ha chance di regnare.

Ma, nè il tipo di alimentazione, nè la cubatura di ogni cella, marca distinzioni tra le classi sociali. L’Apis mellifera che sarà regina, riceve esclusivamente pappa reale, durante tutto lo sviluppo; l’operaia, solo polline; nei Meliponini, invece, tanto le regine, quanto le operaie, si nutriranno tutte di polline. E, per le singole abitazioni, in alveare, nessuna differenza nelle dimensioni delle celle, e nessuna segregazione in periferia, per le operaie. Ovunque, quartieri misti.

Le regine, però, fuoriescono dall’alveare. Devono dar corso alla loro funzione, accoppiarsi. Durante la ricerca, la maggior parte muore. Un destino, a qunto pare, non è, per forza, più felice di un altro.

Nuovi batteri lattici, in Melipona, prossimi probiotici: lo studio

Le api senza pungiglione, che in realtà lo possiedono, eccome, pur ridotto ed inadatto alla difesa, sono impollinatrici delle foreste pluviali; in regioni tropicali e sub-tropicali. Sono 35 le specie, nella penisola della Malaysia e 32 nel Borneo, secondo il precedente studio di Mohd Fahimee Jaapar e colleghi. E’ di Alejandra Vásquez, e del suo gruppo di ricerca, invece, l’attestazione di ben 50 nuove specie di LAB, del genere Lactobacillus e Bifidobacterium, nelle api senza pungiglione. Con vari ed eventuali scopi pratici benefici, in diversi àmbiti.

Ma, finora, le peculiarità del microbiota di api Melipona del Borneo del Nord, del Sabah, erano ancora ignote.

Cronache di laboratorio

Le specie imenottere, oggetto dell’ultimo studio, condotto da Lucky Poh Wah Goh, sono state, precisamente, Geniotrigona thoracica, Heterotrigona itama e Tetrigona binghami, e risiedevano, alcune in area urbana, altre nella profonda foresta tropicale a Kiulu, Kota Kinabalu, Sabah. Inizialmente, i ricercatori hanno raccolto uova delle api senza pungiglione Heterotrigona itama, residenti nella sola area urbana. Quindi, le api hanno subìto un lavaggio con etanolo al 95% (v/v), per una sterilizzazione superficiale, pro-dissezione dei loro tratti addominali, successivamente omogenizzati. Come pure i loro prodotti: omogenizzati e pesati, circa a 0.1 g. Ovvero, pappa reale, miele, propoli.

I campioni omogenizzati, diluiti 10 volte, rispetto alla concentrazione di partenza, vengono inoculati in brodo MRS ed M17, in condizioni anaerobiche, a 30°C, per 48 ore. Dopo incubazione, del brodo di coltura, i ricercatori, ne hanno fatto diluizioni seriali, da 10⁻² fino a 10⁻⁶ , con 0.9% (w/v) di soluzione salina sterile. Un volume di 100 uL, dei campioni diluiti, insemina le piastre di MRS ed M17, supplementate con 0.01% di sodio azide, come reagente di soppressione. Segue incubazione anaerobica, a 30°C, per 48 ore. Una singola colonia, poi, prelevata, e posta in coltura, fa da isolato puro.

Batteri lattici al vaglio, per il ruolo di probiotici

Ben 104 ceppi batterici, sono quelli isolati da api senza pungiglione del Sabah, a partire da 3 specie imenottere, come detto. Rispettivamente, Tetrigona binghami con 48 ceppi, Heterotrigona itama ed i suoi 35 stipiti batterici, ed infine Geniotrigona thoracica a quota 21 ceppi. Lo screening dei LAB è, così, consistito in colorazione di Gram, osservazione morfologica e test della catalasi.

I LAB sono batteri lattici, catalasi negativi e fermentativi stretti. Producono una miscela di acido lattico, biossido di carbonio, acido acetico ed etanolo. Per questo, etero-fermentativi. Alcuni, invece, producono solo acido lattico, quindi omo-fermentativi. Quando i batteri sono all’interno del tratto digerente umano, colonizzano le mucose intestinali, giungendo anche fino alle vie genitali, tanto nell’uomo quanto negli animali. Con notevoli effetti producenti, anche su questi confinanti apparati.

Inoltre, nello studio, i ricercatori hanno coinvolto anche altri tre ceppi, indicatori di potenziali proprietà antimicrobiche, dei LAB: Escherichia coli ATCC 11775, Listeria monocytogenes ATCC 7644, Salmonella enterica ATCC 13076. Salmonella enterica ed Escherichia coli, come Gram negativi; Listeria monocytogenes, Gram positivo. Tutti, agenti eziologici di molte infezioni alimentari.

Identificazione molecolare dei batteri lattici di Melipona

La vera identificazione biomolecolare dei ceppi batterici, nel microbiota di Melipona, si è, come sempre, avvalsa di reazioni di amplificazione genica (PCR) su rRNA 16S. Lo studio successivo delle sequenze, per confronto con le banche dati, ha garantito un chiaro quadro filogenetico dei batteri. Sono, infatti, emersi 86 ceppi Gram positivi e 18 Gram negativi. Tutti i batteri, rilevati in api senza pungiglione, della specie Heterotrigona itama, sono risultati Gram positivi; tra cui 29 cocchi e 75 bacilli. Il test della catalasi, invece, ha restituito 12 ceppi catalasi positivi e 92 ceppi catalasi negativi.

Il tutto, in linea con i risultati degli studi condotti da Mohamed Mustafa Aween e da Nor Hazwani Mohd Hasali. Ma la caratteristica saliente, dei batteri delle api senza pungiglione, per fini probiotici, è l’attitudine anaerobica, che può essere ricostruita proprio col test della catalasi. I 92 ceppi catalasi negativi, infatti, si affermano come anaerobici; e questi sono gli stipiti con chiaro potenziale antimicrobico.

Dalle specie di Melipona, coinvolte nel lavoro analitico, i ricercatori hanno ottenuto 7 isolati batterici: A6, B5, B10, P1b, H4b, B3b ed A2b, in grado, peraltro, di inibire l’attività patogenica del Gram positivo L. monocytogenes ATCC 7644. Tali LAB provengono, invece, da api residenti in profonde foreste pluviali, e, di preciso, dal loro microbiota addominale, dal pane d’api (polline crudo), da propoli e miele. Al contrario, tutti gli isolati batterici, ben 104, non manifestano attività antimicrobica contro Gram negativi, come E. coli ATCC 11775 e S. enterica ATCC 13076. Anche questa capacità microbicida Gram-specifica, invoglia futuri approfondimenti.

Isolati batterici ed identità filogenetica

Le interpolazioni filogenetiche, post-amplificazione genica, dunque, assegnano all’isolato A6 un’identità strettamente correlata alla specie Lactobacillus pentosus. I ceppi B5 e B10, invece, correlano con Weissella paramesenteroides, e gli isolati P1b, H4b, B3b e A2b, tutti Enterococcus sp.

Studi precedenti supportano i dati sperimentali antimicrobici ottenuti, inducendo i ricercatori a ritenere che la batteriocina sia centrale nella funzione anti-patogena, dei batteri di api senza pungiglione, per la sua bioattività a spettro ristretto; contro Gram positivi, oppure, contro Gram negativi. Tuttavia, in molti casi, la batteriocina potrebbe inibire entrambi i tipi batterici.

Così come, gli studi di C. Gaspar hanno avvalorato la produzione di nuove batteriocine, da parte di queste specifiche specie batteriche, in grado di inibire, ad ampio spettro, sia patogeni che batteri antibiotico-resistenti, come gli Enterococchi vancomicina-resistenti (VRE).

Caratterizzazione biochimica dei batteri di Melipona

Effettuato il test di fermentazione del carbonio, i ricercatori hanno riconosciuto che tutti gli isolati siano in grado di utilizzare il glucosio come fonte carboniosa. Inoltre, essi non sono capaci di idrolizzare l’amido, così come non possiedono attività proteolitica. I batteri, futuri probiotici, dunque, non possiedono nè amilasi nè proteasi. Di fatto, l’assenza di azione proteolitica, negli isolati LAB è imputabile all’ambiente di crescita dei batteri, ricco in carboidrati e privo di proteine.

Comprova tale esito, lo studio di Israel Garcìa-Can, nel quale i batteri lattici possedevano, eccome, attività proteolitica, a fini di estrazione aminoacidica, per esigenze di metabolismo batterico stesso, poichè i ceppi risiedevano in prodotti lattiero-caseari. Molto diversamente, quindi, dai batteri residenti nelle api senza pungiglione e nei loro prodotti. E per l’applicazione dei ceppi batterici, in campo industriale caseario, i processi di acidificazione e coagulazione della matrice lattea sono, a dir poco, essenziali.

Doti da probiotici: ultima chiamata, per i batteri di Melipona!

Tutti, i 7 ceppi di LAB, sono, qui, in grado di abbassare il pH del mezzo in cui si trovano, da 6.4 a 4.1, circa. Dopotutto, l’acidificazione del latte offre agli operatori un controllo diretto su patogeni e microrganismi alterativi, dei prodotti fermentati. Gli isolati, in questo studio, garantiscono un’acidificazione, anche abbastanza rapida, nell’arco delle 24 ore; si configurano, quindi, come buoni coadiuvanti di processo. La coagulazione del latte, invece, si svolge tra le 24 e le 72 ore, con le specie Enterococcus sp. e Lactobacillus sp., le più rapide.

Naturalmente, acidificazione e coagulazione del latte generano anche aromi diversi, in base ai metaboliti espressi dai batteri presenti: acido acetico, propionico, acetone.

Ma soprattutto, quando si parla di batteri per cui si preconizza un futuro da probiotici, resta il nodo centrale della loro effettiva resistenza agli acidi gastrici ed ai sali biliari intestinali. I dati di studio confermano elevate conte cellulari viventi, anche a pH tra 2 e 5. Eccetto per Enterococcus sp., che non sarà l’ideale probiotico. Gli altri isolati, invece, idrolizzano i sali biliari, senza alterazione della propria morfologia, sia in condizioni di aerobiosi, sia di anaerobiosi.

Sale, temperatura e resistenza agli antibiotici

Ma, poichè il tratto digestivo non contiene solo sali biliari, i ricercatori hanno valutato anche il comportamento batterico in ambiente con NaCl. I 7 ceppi isolati principali hanno risposto con tolleranza superiore, al 6% di NaCl. Ma, tra 8% e 10%, essi soffrono rallentamento e blocco di crescita. Ultimo, fondamentale, dato tecnologico, per l’industria casearia: visto che, cattiva tolleranza salina, vuol dire riduzione del turgore cellulare, squilibrio osmotico, con madornali ripercussioni sull’attività enzimatica, sull’attività dell’acqua e sulla fisiologia cellulare in genere.

Resta che, durante i processi di fermentazione, i LAB producono acido lattico: quindi, soluzioni alcaline possono sempre essere aggiunte, al brodo di coltura, per scongiurare l’iperacidificazione del mezzo.

La temperatura enterica, come quella di processo industriale, è un altro requisito imprescindibile, per ottenere il ruolo di probiotico. Enterococcus sp. e Lactobacillus sp. hanno crescita ottimale a 25°C e 37°C. Weissella sp., invece, predilige i 25°C-28°C, e 37°C come temperatura sub-ottimale. Tuttavia, i ricercatori hanno registrato anche l’unanime sensibilità dei ceppi batterici, delle api senza pungiglione, agli estremi termici ( 4°C- 80°C). Sono ben lungi, quindi, dalla psicrofilìa e dalla termofilìa.

La sicurezza dei batteri lattici e loro antibiotico-resistenza

La salubrità dei ceppi batterici, che in futuro creeranno, ed abiteranno, i nostri alimenti, e quindi noi, i ricercatori l’hanno qui valutata con un saggio di suscettibilità, ad una batteria di 24 antibiotici. Tra inibitori di sintesi proteica, di sintesi di DNA, di acido folico ed altri.

Le specie batteriche Enterococcus sp., residenti in api H. itama, hanno tutte la stessa suscettibilità agli antibiotici, pur con meccanismi di reazione differenti. I ceppi di Weissella sp. e di Lactobacillus sp., invece, isolati nelle altre due specie di api Melipona, hanno tutti lo stesso, alto, grado di sensibilità ai farmaci. Per fortuna.

I ceppi LAB resistenti agli antibiotici non sono propriamente consigliabili, pur con i dovuti distinguo di applicazione. Se, infatti, da un lato, sembrerebbero convenienti, in sede di eradicazione, lunga e chemio-onerosa, dell’Helicobacter, per esempio, si teme sempre che essi portino con sè, un infausto fardello di geni di resistenza, da prestare alle cellule circostanti. E non c’è nulla che spaventi di più, la ricerca medica, della diffusione dell’antibiotico-resistenza. Neppure un esercito di patogeni.