Formazione di biofilm e Meccanismi di dispersione batterica: possiamo impedirne la formazione o influenzare la loro struttura?

La formazione di biofilm batterici

I batteri possono creare strutture definite come biofilm. Talvolta, queste sono molto difficili da sradicare e possono anche racchiudere una seria minaccia per la salute pubblica se si considerano quelli costituiti da organismi patogeni per l’uomo. I batteri possono anche allontanarsi dal biofilm originario in caso di condizioni limitanti, quindi possono disperdersi e colonizzare nuovi ambienti.

I meccanismi di dispersione dei biofilm sono noti solo per alcuni tipi di batteri. Tra questi vi è la formazione di spore in Bacillus subtilis in cui si è notato un fenomeno particolare legato al cambiamento delle caratteristiche nella morfologia del biofilm e del processo di dispersione in base alla variazione della concentrazione di ione calcio.

Formazione e funzione dei biofilm

I batteri possono aderire ad una superficie e dare vita a comunità multicellulari: i biofilm (Fig. 1). Lo sviluppo di tali strutture prevede più fasi: adesione di una cellula planctonica a una superficie, formazione e crescita del biofilm quindi allontanamento delle cellule (“biofilm dispersal”).

L’obiettivo finale della comunità è quello di creare un microambiente utile ai batteri residenti a trattenere acqua, nutrienti, enzimi extracellulari ma anche avere protezione contro antibiotici e fenomeni di stress ambientale.

L’aumento del numero di cellule nella colonia, la riduzione delle risorse, la limitazione dell’ossigeno o l’accumulo di rifiuti possono scatenare la fuga di alcune cellule dalla struttura. Questo fenomeno, detto dispersione, prevede la secrezione di sostanze (tipo enzimi di degradazione dei polisaccaridi, proteasi, nucleasi e biosurfattanti) utili a smontare i componenti della matrice e la diffusione delle cellule planctoniche in nuovi luoghi così da ottenere la formazione di nuovi biofilm in ambienti con condizioni migliori.

L’analisi condotta su Bacillus subtilis

Bacillus subtilis viene considerato come organismo modello per molti studi, infatti molti fenomeni microbiologici sono stati analizzati studiando le sue caratteristiche e/o comportamenti. Questo batterio Gram-positivo forma spore. Tali spore possono disperdersi nell’ambiente e permettono lo sviluppo di colonie laddove possibile, pertanto nascono nuovi biofilm robusti (colonie solide) o galleggianti sulla superficie di mezzi liquidi.

Le strutture nascono grazie a esopolisaccaridi, polimeri proteici di fibre amiloidi TasA e idrofobine BslA. Questi componenti sono sintetizzati dall’operone a 15 geni epsA-epsO, l’operone tapA-sipW-tasA e bslA, rispettivamente. Questi geni della matrice del biofilm sono repressi dai repressori trascrizionali AbrB e SinR. Inoltre, sono necessari più attivatori trascrizionali per ottenere l’espressione di questi geni della matrice.

L’analisi sulla dispersione di B. subtilis non è stata approfondita ma studi preliminari riportano l’attivazione del fattore sigma alternativo reattivo allo stress σ^B che induce la dispersione aumentando la trascrizione di sinR.

Due meccanismi associati alla dispersione

Le analisi sono state condotte sfruttando fusioni trascrizionali di proteina fluorescente verde (GFP) inserite nel cromosoma di un preciso ceppo e con l’osservazione mediante citometria a flusso (Fig. 2). Un ceppo, detto wild-type (senza segnalatore GFP), è stato usato come controllo negativo.

Le osservazioni ottenute sono state riportate nel paragrafo precedente in cui si è parlato dell’espressione di alcuni geni della matrice del biofilm che possono causare la dispersione del biofilm. Inoltre, la sovraespressione o la diminuzione dell’espressione del solo operone epsA ha parzialmente impedito la dispersione del biofilm.

Successivamente, si è valutato il fenomeno della sporulazione (Fig. 3) per capire se anche questo può essere coinvolto dispersione. Sono stati coltivati mutanti con delezioni di geni che codificano fattori sigma specifici della sporulazione: σ^F, σ^E, σ^G, e σ^K.

Questi fattori sigma sono attivati nell’ordine indicato durante la sporulazione, e l’attivazione di σ^K richiede l’azione dei precedenti fattori. In tali mutanti si nota una dispersione biofilm più mite rispetto al wild-type e che sicuramente un gene associato alla sporulazione, σ^K-dipendente, è coinvolto nella dispersione del biofilm.

E’ stato quindi ipotizzato che un meccanismo dipendente dalla sporulazione potrebbe causare la dispersione del biofilm. Questi risultati, presi insieme, sono utili a concludere che due meccanismi, quindi diminuzione dell’espressione dell’operone epsA e un meccanismo sconosciuto σ^K-dipendente, provocano la dispersione del biofilm.

L’influenza del calcio sulla formazione di biofilm

Per determinare quale metallo influenza la dispersione dei biofilm, sono stati gradualmente rimossi elementi dal terreno di coltura. La rimozione del calcio (Fig. 4) non ha influenzato la formazione del biofilm, ma ha indotto la dispersione. Al contrario, la rimozione di manganese ha compromesso la formazione di biofilm mentre la rimozione di magnesio o ferro non ha avuto alcun effetto sulla formazione/dispersione di biofilm.

Oltre le reazioni scaturite dalla riduzione delle concentrazioni di determinati elementi, si è osservato che l’aggiunta di calcio non ha alterato l’espressione dei geni della matrice del biofilm e della sporulazione ma non di quelli coinvolti nella dispersione, tra cui l’operone epsA.

In particolare, questi ultimi risultati indicano che il calcio stabilizza l’architettura del biofilm, anche se parallelamente l’espressione dei geni della matrice del biofilm diminuisce e viene innescata la sporulazione. A tal proposito, si ipotizza che il calcio potrebbe stabilizzare i biofilm, non impedisce la loro formazione ma cambia positivamente la morfologia del biofilm rafforzando la struttura della matrice.

Il calcio e l’architettura delle colonie

L’aggiunta di calcio al mezzo ha impedito la dispersione del biofilm. In presenza di calcio, i biofilm sono rimasti indisturbati per almeno cinque giorni dopo l’inoculazione, mentre l’espressione dei geni della matrice del biofilm è diminuita drasticamente al secondo giorno. Tale riduzione ha modificato l’architettura delle rughe sulla superficie dei biofilm che apparivano poco numerose e parzialmente visibili.

Normalmente queste rughe nascono poiché i fasci di catene cellulari non possono allungarsi liberamente a causa delle interazioni fisiche con altri fasci e la crescita cellulare produce una distorsione all’interno dei fasci stessi. Parte dei fasci vengono spinti nell’aria e si formano queste rughe superficiali.

Le rughe attenuate in assenza di calcio, suggeriscono che i fasci di catene cellulari non sono strutturalmente abbastanza robusti da sostenere la crescita verso l’alto quando questo elemento è assente. Pertanto, la morfologia del biofilm è fortemente legata alla concentrazione di calcio che, variando nella sua concentrazione, può rafforzare o indebolire la struttura complessiva determinando la formazione di una superficie più o meno liscia/rugosa.

Il rapporto tra Ca-DPA e fenomeno di dispersione

L’operone spoVF, in B. subtilis, codifica la DPA sintetasi. L’acido dipicolinico, anche detto DPA (Fig. 5), contiene proteine piccole solubili di tipo alfa/beta che proteggono il DNA. Questo acido viene accumulato insieme al calcio, formando sale di calcio e torna utile al batterio per proteggere e stabilizzare il materiale ereditario.

In riferimento a presenza o assenza di calcio e l’enorme quantità di Ca-DPA che viene sintetizzata e immagazzinata nelle spore durante la sporulazione, si può affermare che i processi di formazione del biofilm e sporulazione competono tra loro in caso di scarsa concentrazione di questo elemento.

Per il verificarsi del fenomeno di dispersione a bassi livelli di calcio mediante la formazione di una spora ed il successivo distacco, la maggior parte degli ioni calcio legati ai componenti della matrice biofilm può essere trasportato all’interno delle spore come Ca-DPA durante la sporulazione (Fig. 6).

In questo scenario, quando il livello di calcio extracellulare è basso, gli ioni calcio legati ai componenti della matrice del biofilm funzionano come un serbatoio da cui le cellule possono importare ioni utili a supportare la formazione delle spore e poter proseguire con i processi di dispersione-distacco. In aggiunta, è stato verificato che tale fenomeno, definito come “biomineralizzazione del calcio”, all’interno del mezzo avviene maggiormente quando il pH diventa alcalino (pH 8.3).

Conclusioni

I risultati di studi condotti sulla dispersione nel biofilm, per ciò che riguarda B. subtilis, rivelano che due meccanismi causano tale fenomeno. Quanto riportato suggerisce che un approfondimento in merito a questo aspetto può essere cruciale nell’individuare tecniche utili a limitare lo sviluppo, su specifiche superfici/ambienti, di comunità microbiche pericolose per la salute umana.

Inoltre, la particolare intuizione relativa ai livelli di calcio nel mezzo ha consentito di osservare che questo elemento ha contrastato i meccanismi di dispersione, non ha provocato alterazioni nell’espressione genica inerente a tale fenomeno ed ha influito positivamente sulla stabilizzazione dei biofilm.

Di conseguenza, anche l’analisi dei meccanismi di risposta riferiti alla riduzione della concentrazione di calcio negli ambienti può essere un passo importante per la definizione di metodi che possano limitare la formazione di spore e la crescita/diffusione di biofilm potenzialmente patogeni.

Gennaro Velotto

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• Fig. 2 – https://www.britannica.com
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• Fig. 5 – Eric, slideshow.com