Non di tranello tradotto nelle troiane mura (figura 1), tratta l’ultimo studio, finanziato dal Ministero Spagnolo della Scienza, Innovazione e Università, sul processo di endocitosi spontanea riguardante Lactobacilli probiotici e cellule dell’epitelio intestinale umano. Ma di una promettente collaborazione offerta dai batteri lattici, allo spessore delle nostre fisiche, intime, principali difese. Nell’insieme, dette intestino.
National Gallery, Londra.
Fonte [wikipedia]
Barriera compiacente: segni e motivi d’una endocitosi spontanea
Tutte le membrane biologiche, senza distinzione tra eucariotiche, nucleate vite, e procariotiche geneticità libertine, hanno natura lipidica. Pèrvie quindi per affinità a molecole liposolubili; non a quelle idrosolubili. Barriere protettive che si frappongono tra l’Essere cellulare, ed in Non-Essere microambientale. Contenzione che sconfinerebbe nell’isolamento mortifero, se le teorie di fosfolipidi in bilayer non ammettessero intercalanti proteici; integrali o di superficie, proteine.
Le integrali, trapassano infatti da parte a parte la corposa barriera: a volte tappezzandone un poro; altre, solo sporgendo pazientemente con le estremità nei due regni; del Fuori e del Dentro. Con il Fuori, l’escluso, che ha beni essenziali per l’Ente di Dentro. Ha risorse, e spazio di smaltimento quieto, per le scorie; inservìti scàmpoli, opachi avanzi di processo.
Dunque, quello sporgere nel Χάος di matrice extracellulare, fa, delle proteine recettoriali, esche in attesa di un alterante allosterico legame con l’abboccante occasione. Mentre, nel citologco Κόσμος, intanto, elasticizzanti identità proteiche si accosteranno alla membrana e la forzeranno ad un abbraccio ignoto. Ad inghiottire, cioè, quel frutto del Mondo; quale che sia; molecola o microbo; sperando non sia una « perfida sorba », da dover risputare pur di scamparvi.
Lactobacilli: modello di commensalità proficua, fondato su dati patogeni
Lo studio dell’ingresso batterico in cellule epiteliali intestinali origina, però, dalle frequenti e ferali urgenze patologiche. Infatti, su stipiti temibili si concentra, da sempre, la maggior parte degli studi, i cui dati compongono poi l’estesa letteratura. Escherichia coli, Campylobacter jejuni, Salmonella typhimurium, Pseudomonas aeruginosa, Streptococcus pyogenes. Tutti hanno sviluppato meccanismi di espugnazione del valico cellulare. Con i primi passaggi dell’invasione patologica, caratterizzati da endocitosi mediata da clatrina e caveolìna.
Caveolìna, ovvero, proteina di cavità. Costanti piriformi, le cavèole, nell’evenienza di un traghettamento molecolare o corpuscolare dall’esterno verso l’interno della cavità maggiore: quel κύτος, che per noi fu cellula. Ma le cavèole sono anche un potenziale di resilienza cellulare a fenomeni d’imprevista distensione meccanica.
Tre catene polipeptidiche pesanti, e tre leggere, unite a formare una triraggiata struttura: τρισκελής. Tre spirali intrecciate; ed ogni altro simbolo con triplice simmetria rotazionale, fissata come fu nella monetazione greca ed in quella romana. Creduta simbolo orientale, della luna, del sole, del moto (figura 2), la τρισκελής. E di moto si tratta anche in questa poliedrìa dell’eponima. Poiché, più d’una trìscele unita, forma pentagoni o esagoni; e questi, una struttura icosaedrica finale. Connotato evidente, la sbarra, clatra in latino. Questa, dunque, la proteica clatrina (figura 3), che per interposta adattina, si approssima, dall’interno cellulare, alle zone di membrana invaginande, e le trae a sé; fautrice così d’incavi esterni, sul plasmalemma di cinta; incavi, pronti persino a farsi navette vescicolari, per estranei visitatori.
Fonte [wikipedia].
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Stato ottimale degli enterociti, in cui l’endocitosi ha luogo; meccanismo d’internalizzazione dei Lactobacilli; a questo, guarda la Ricerca
Alcuni Lactobacilli probiotici possiedono strutture piliformi o proteine di superficie specializzate, con cui efficientemente legàr altre proteine, come quelle della matrice extracellulare, prima di avviarsi all’endocitosi. Un esempio all’altezza dell’ottima opinione che dei batteri lattici si ha, è rappresentato da Weissella cibaria, e dalla sua Proteina A legante la Fibronectina (FbpA); poiché inibisce l’adesione di Staphylococcus aureus a cellule epiteliali mammarie, secondo Wang e colleghi. Per competizione pare, ed impedendo l’internalizzazione dei patogeni.
Ancora. Studi precedenti riportano spontanea endocitosi in cellule epiteliali intestinali (figura 4) in vivo ed in vitro, per Lactococcus lactis, Lactiplantibacillus plantarum e Lacticaseibacillus paracasei; per espressione di proteine patogene superficiali di adesione, o di singole catente anticorpali. Ottenendo, con ciò, efficace trasfezione.
Eppure, i passaggi che seguono all’adesione, come pure lo stato fisiologico delle cellule dell’epitelio intestinale, ed il meccanismo molecolare che sostanzia il fenomeno a fior di membrana, restavano finora concettualmente incompleti.
Quali Lactobacilli, spontaneamente, sono accolti negli enterociti, e perché?
Lacticaseibacillus rhamnosus e Lacticaseibacillus paracasei sono specie correlate, pur con differenti profili microbici individuali. Ed ampiamente coinvolti nei modelli sperimentali. Lacticaseibacillus rhamnosus, innanzitutto, fronteggia coliti ulcerose e dissenteria, ma anche dermatiti atopiche. Come, d’altra sponda, Lacticaseibacillus paracasei ribatte con la cura di sindromi diarroiche; ferali compagne dei trattamenti antibiotici intensivi e protratti. Per di più, quest’ultimo ceppo probiotico si dimostra agente preventivo di collaterali guai da infezione di Clostridium difficile.
Infine, Lacticaseibacillus rhamnosus è noto impedire l’ingresso nelle difese cellulari intestinali dell’ Escherichia coli enteroemorragico (EHEC).
Retroscena dell’endocitosi e dei rapporti tra Lactobacilli e cellule dell’epitelio intestinale, che ne sono osti: lo studio
L’intima relazione tra batteri probiotici e cellule ospiti intestinali umane è il nodo da cui si dipana il lavoro sperimentale guidato da Ramirez-Sánchez e colleghi. Volto a valutare anche eventuali fattori fisiologici, agenti sulle cellule epiteliali, e a favorire l’endocitosi in esse dei Lactobacilli.
Ceppi coinvolti nella sperimentazione sono:
- Lacticaseibacillus paracasei BL23,
- Lacticaseibacillus rhamnosus LGG.
Le linee cellulari riceventi i batteri, in grado di costituire modello sperimentale intestinale invece sono:
- Caco-2 (ATCC HTB-37),
- T84 (ATCC CCL-248).
I ricercatori, dunque, per riuscire innanzitutto a stimare la quota di batteri trasportati all’interno delle cellule epiteliali enteriche (IECs ), hanno allestito il test di protezione gentamicina standard.
Seminate così aliquote cellulari su piastra da 24 pozzetti (Transwells inserts -Costar®; Cole-Parmer, Vernon Hills, IL, USA -24 mm diametro; 3.0 μm dimensione dei pori), nell’ordine di 2 × 105 cells/mL per la linea cellulare Caco-2, e di 6 × 105 cells/mL per la linea cellulare T84. Quindi incubazione a 37°C, con una quantità di CO2 tra 95-100% per Caco-2, e tra 70-80% per T84. Prima della co-incubazione, di batteri e cellule epiteliali sperimentali, il mezzo di coltura è stato tuttavia rinnovato. Eliminando quello iniziale, che aveva subìto addizione di antibiotici (1% penicillina-streptomicina), per ottener valore di molteplicità d’infezione (MOI); rapporto, questo, tra numero di agenti infettanti (batteri) e numero di cellule infettate (enterociti), presenti nel sistema sperimentale.
Infine, incubazione delle cellule epiteliali con i ceppi probiotici BL23 ed LGG; a MOI 1000, 37°C, e 5% di CO2.
Dal test di protezione gentamicina standard, alla fluorescenza: strategie e metodi d’indagine delle debolezze dell’endocitosi
Le condizioni potenzialmente d’ostacolo al processo di ingresso dei Lactobacilli in cellule dell’epitelio intestinale umano, i ricercatori le hanno incalzate e conseguite con l’ausilio di citochine: IFN-γ, citocalasina D, EIPA, rapamicina, dynasore idrato, ML7, fattore di crescita epidermico (EGF). Dissolti in colture cellulari prive di antibiotici.
Ebbene, il test di protezione gentamicina standard, ha rivelato che il ceppo BL23 sia accolto più efficacemente nelle cellule T84, rispetto alle cellule Caco-2. Al contrario, il ceppo batterico LGG si comporta in modo simile in entrambe le linee cellulari. Per conseguenza, al confronto tra i due stipiti batterici, l’ingresso per endocitosi del batterio BL23 è minore nelle cellule Caco-2, rispetto al ceppo LGG; ma è anche significativamente maggiore di LGG, in cellule T84.
Questo primo dato suggerisce che l’endocitosi dei due ceppi coinvolga ligandi diversi. Così, mediante microscopia a fluorescenza, microscopia confocale, e l’impiego di un ceppo ricombinante di BL23, cioè BL23 [pT1-GR::p127], dalla minore efficienza endocitotica, i ricercatori hanno concluso quanto segue. Le cellule batteriche, innanzitutto, non sono uniformemente distribuite, al di là dello strato di cellule epiteliali; ma piuttosto aggregate in regioni marginali, in aderente confluente crescita, per entrambe le linee enteriche coinvolte. Con Lactobacilli numerosi e intatti, nel citolplasma delle cellule ospiti.
Effetti delle citochine, inibitorie e stimolanti l’omeostasi cellulare enterica, sull’efficienza di introiezione dei Lactobacilli
I ricercatori hanno in realtà condotto il test di protezione gentamicina standard dopo stimolazione delle cellule epiteliali in pre-incubazione con IFN-γ (100 e 1000 IU/mL), e con EGF (50 e 100 ng/mL); due notevoli regolatori dei processi cellulari. Infatti IFN-γ regola infiammazione ed autolisi; àltera le giunzioni strette della barriera intestinale; il fattore di crescita dell’epidermide, dal canto suo, promuove la divisione cellulare.
Così, i dati raccontano di un incremento di endocitosi dei Lactobacilli LGG in Caco-2, ma non del ceppo LB23. E l’osservazione microscopica del processo di introiezione, dopo stimolo interferonico, ha mostrato la presenza di cellule batteriche ricombinanti BL23 [pT1-GR::p127], con discreta quantità di proteine fluorescenti dei ceppi diffusi, contenute in vescicole. Il che spiegherebbe qualche discrepanza d’esito tra test di protezione gentamicina standard e la citometria a flusso. Il primo test si esprime in ternimi di CFUs, quindi unità vitali, come nella citometria a flusso si manifestano eventi fluorescenti singoli; cioè cellule epiteliali che possono aver incluso in sé uno o più batteri. Non tutti necessariamente ancora vivi, all’interno della cellula ospite; che tuttavia sarebbero contati come eventi fluorescenti regolari.
Le osservazioni al microscopio, inoltre, indicano un’iniziale abbondanza batterica nelle cellule ospiti, alla periferia della loro confluenza di crescita. E la stimolazione delle colture cellulari epiteliali con fattore di crescita EGF ha comportato incremento d’endocitosi del ceppo BL23 in cellule T84. Il ceppo LGG, invece, ha mostrato incremento d’ingresso in entrambe le linee cellulari epiteliali.
Quando, dunque, le cellule dell’intestino umano, inglobano meglio i probiotici?
I dati finora raccolti suggeriscono che l’endocitosi di Lactobacilli in cellule dell’epitelio intestinale, come BL23 in Caco-2, sia correlata ad un stadio precoce della vita cellulare; quello, cioè, di crescita attiva. E, grazie ad analisi di regressione, i ricercatori sono anche certi che l’introiezione di batteri in cellule ospiti corrèli inversamente con lo stadio di differenziamento cellulare. Quindi, l’endocitosi è più frequente ed efficace, soprattutto, nelle cellule meno differenziate; giovani cellule, in attiva proliferazione.
Meccanismo molecolare della spontanea ospitalità
Il metodo sperimentale procede per insulti dei sistemi che intende studiare; e così, per individuare gli eventuali fattori molecolari coinvolti nel processo d’endocitosi, i ricercatori si sono serviti di inibitori biochimici specifici.
EIPA, tra questi, non ha inciso significativamente sull’endocitosi relativa di nessuno dei probiotici considerati, in ciascuna linea cellulare epiteliale. Rapamicina, invece, pur priva di effetti salienti durante il test di protezione gentamicina standard, ha tuttavia mostrato effetto rilevante, in citometria a flusso, sull’endocitosi del ceppo ricombinante BL23 [pT1-GR::p127], in cellule T84, già a basse concentrazioni dell’inibitore. Esso è infatti un agente responsabile di autolisi cellulare, quindi in grado di ridurre le conte vitali.
Ancòra. Citocalasina D, ad entrambe le concentrazioni impiegate (1 e 5 µg/mL), ha ridotto la frequenza di endocitosi di entrambi i ceppi probiotici. E questo dato parla dell’essenzialità della corretta polimerizzazione di un noto elemento contrattile, coinvolto nel processo di invaginazione della membrana cellulare, in sede di endocitosi, qual è l’actina.
Infine, ML7, inibitore della chinasi della catena leggera della miosina (MLCK), e dynasore inibitore dell’attività GTPasica occorrente alla dinamina per attuare endocitosi clatrina e caveolina dipendenti, hanno ridotto lievemente l’ingresso di LGG. Nessun effetto su BL23. Strenuamente esso resta il ceppo, tra i Lactobacilli probiotici vagliati, più facilmente introiettato dalle cellule intestinali umane, nel presente modello sperimentale. Sulla linea cellulare T84, infine, i due inibitori non distolgono né l’uno né l’altro ceppo, dalla richiesta d’asilo.
Endocitosi, e poi?
I ricercatori si sono domandati se e quanto i batteri probiotici, così naturalmente accolti nelle cellule epiteliali enteriche, in crescita attiva e non del tutto differenziate, sopravvivessero poi in casa dell’ospite. In questo, il test di protezione gentamicina standard, ampliato nel suo tempo di incubazione, fino a 72 ore, ha dato alcune risposte.
La gentamicina ha conservato attività antibatterica, quindi BL23 ed LGG sono sopravvissuti in Caco-2 per 24 ore, decrescendo però dopo 3 giorni (72 ore), fino all’1% ed al 3% rispettivamente. Nella linea cellulare T84, invece, le conte vitali di BL23 crescevano dopo 24 ore e 48 ore, con ciò ventilando l’ipotesi di una replicazione cellulare batterica all’interno dell’ospite intestinale. Tanto, confermato anche da una sopravvivenza probiotica superiore al 71% del valore iniziale di conta, trascorse 72 ore.
Quando il test di protezione gentamicina standard è stato dai ricercatori condotto sul ceppo ricombinante BL23 [pT1-GR::p127], devitalizzato con gentamicina 300 µg/mL e cloramfenicolo (25 µg/mL), nessuna CFU in cellule epiteliali T84 è stata conteggiata. Eppure, in microscopia confocale, anomale morfologie fluorescenti, all’interno delle cellule ospiti, erano sì balzate all’occhio; segnale, quindi, che anche batteri non vitali possano essere introdotti nelle cellule intestinali per endocitosi.
Endocitosi. Poi sopravvivenza, replicazione, creazione del biofilm
Quel Velo di Maya, il biofilm, cela e scalda la brama di sopravvivenza dei batteri in luoghi altrui. Le osservazioni al microscopio, a tal riguardo, del fluorescente ceppo BL23, hanno restituito occasionale accumulo di cellule batteriche sulla superficie del monostrato epiteliale intestinale umano. In altri tessuti, la formazione di biofilm favorisce, com’è noto, l’attacco batterico alle superfici dell’ospite; o dovremmo dire dell’ostaggio?
Ma dalla prospettiva batterica, la capacità di creare biofilm è dote premiata dalla agognata propagazione nel tempo; dall’essere, e dall’esserci.
Come il ceppo LGG, introiettato per endocitosi e prosperante indistintamente sia nella cellulare linea enterica Caco-2, sia nella T84. Proprio per un buon biofilm sopravvenuto.
Dunque, ospiti o ostaggi, le nostre cellule intestinali?
Per determinare se i batteri portati con fiducia nelle proprie sacre mura fosfolidiche, abbiano per le cellule intestinali epiteliali poi rappresentato un tranello d’Achee Genti, oppure un opportuno innesto, biochimico prima, e genetico poi, ancòra un saggio. I ricercatori hanno posto in incubazione le due linee cellulari intestinali con il ceppo ricombinante BL23 [pT1-GR::p127], per 4, 24 e 48 ore; e valutato la vitalità cellulare con l’ausilio della microscopia epifluorescente.
Ebbene, le conte cellulari hanno escluso ogni responsabilità dell’ingresso lactobacillare nella occorrenza di morti cellulari enteriche. Anzi, poiché i Lactobacilli sono in grado di sopravvivere nel citoplasma, vi è anche consistente possibilità che essi possano essere trasferiti finanche sul lato basolaterale del monostrato cellulare; senza con ciò crear danno alcuno alla integrità del tessuto intestinale.
Conferme di ciò giungono da saggio conclusivo di transcitosi, in cui, a tali condizioni sperimentali, non sono rilevate CFUs dopo incubazione con entrambi i batteri, nella linea cellulare T84. Ma anche la linea cellulare Caco-2 ha dimostrato una eccellente stabilità, ed a tempi superiori alle 24 ore. Con le conte, nel comparto basolaterale, che hanno indicato transcitosi di BL23 in Caco-2, superiore rispetto al ceppo LGG; nonostante il suo vantaggio demografico.
«Temo i Dànai, e più quand’offrono doni»
Palazzo Te, Mantova.
Fonte [mitologica]
– «Timeo Danaos et dona ferentes»
Virgilio, Eneide, Libro II, 49. (figura 5)
– No, sapiente e sfortunato Laocoonte. Questa volta, no.