Principio del Chromogenic Coliforms Agar
Il Terreno Cromogeno per i Coliformi (CCA Agar; Fig.1), come indica il suo nome, è un terreno cromogeno per il rilevamento di Escherichia coli e altri coliformi all’interno di campioni di acqua (in accordo con quanto previsto dalle ISO 11133/9308).
Utilizzo
Il CCA Agar è un terreno selettivo molto importante, poichè E. coli, così come gli altri coliformi fecali, risultano essere degli importanti indicatori di igiene delle acque.
Ne viene comunque consigliato l’utilizzo per la valutazione di acque che si presuppone non essere particolarmente contaminate (es. acqua potabile, acqua delle piscine).
Composizione e preparazione del Chromogenic Coliforms Agar
La composizione del CCA Agar è riportata in Tabella 1:
| Ingredienti | Quantità (g/L) |
| Digerito enzimatico di caseina | 1 |
| IPTG (isopropylthio-β-galactoside) | 0,1 |
| Cloruro di sodio | 5 |
| Triptofano | 1 |
| Estratto di lievito | 2 |
| Sodio di-idrogeno fosfato | 2,7 |
| Agar per batteriologia | 10 |
| Salmon-beta-D-Galattoside | 0,2 |
| Piruvato di sodio | 1 |
| Tergitol(R) 15-S-7 surfactante | 0,15 |
| Sale di X-beta-G-glucuronide CHX | 0,1 |
| Sodio di-idrogeno fosfato x 2H2O | 2,2 |
| Sorbitolo | 1 |
Alcuni degli ingredienti del terreno, come il peptone, il sorbitolo e il piruvato, garantiscono un rapido sviluppo delle colonie e la possibilità di individuare anche la presenza di coliformi parzialmente danneggiati dal calore.
Al contempo, il tergitolo inibisce la crescita dei batteri Gram positivi e di altri batteri Gram negativi, ad eccezione degli interessati.
Risultati attesi
La beta-glucuronidasi è sfruttatata per l’identificazione specifica di E. coli, essendo del tutto assente nella parete degli altri coliformi. Il substrato cromogeno, infatti, contiene Salmon-GAL e X-glucuronide: la beta-D-galattosidasi, tipica di tutti i coliformi, scinde il Salmon-GAL conferendo alle colonie un tipico color rosso salmone. Al contrario, la beta-D-glucuronidasi, tipica esclusivamente di E. coli, scinde l’X-glucuronide rendendo le colonie blu.
Siccome E. coli, dotato di entrambi gli enzimi, va a scindere entrambi i substrati cromogeni, il colore risultate delle colonie sarà simile al viola scuro (Fig.2).
L’aggiunta del triptofano, inoltre, rende possibile l’attuazione del Test dell’indolo per una ulteriore identificazione biochimica di E. coli.
Per il conteggio delle colonie di E. coli e degli altri coliformi bisogna far riferimento alla norma ISO 9308.
Tuttavia, i passaggi base sono i seguenti:
-pipettare il campione di acqua al di sopra di specifiche membrane collocate sul CCA agar;
-incubare il terreno, invertito, per 21 h a 36°C;
-contare le colonie rosa-rosse (per attività della beta-D-galattosidasi) dei coliformi;
-contare le colonie blu-viola (per attività della beta-D-glucuronidasi) di E. coli;
-sommare le colonie rosa-rosse a quelle blu-viola per ottenere il numero delle colonie di coliformi totali.
In alcuni casi, i batteri ossidasi-positivi (es. Aeromonas) possono sviluppare colonie rosa-rosse, tuttavia, possono essere identificati tramite il test dell’ossidasi che sarà negativo per i coliformi.
Controllo qualità
La polvere del terreno di coltura deve risultare fine e di color beige, per quanto riguarda la crescita delle colonie, i parametri del controllo qualità da rispettare sono indicati in Tabella 2:
| Microrganismi | Grado di crescita | Descrizione della crescita |
| Pseudomonas aeruginosa ATCC 10145 | Crescita | Colonie incolori |
| Klebsiella aerogenes ATCC 13048 | Crescita buona >70% | Colonie rosa-rosse |
| Enterococcus faecalis ATCC 19433 | Inibita | |
| Escherichia coli ATCC 25922 | Crescita buona >70% | Colonie blu-viola |
| Escherichia coli ATCC 8739 | Crescita buona >70% | Colonie blu-viola |
Fonti
- Scheda Tecnica Condolab;
- ISO 9308-1/2014 Water quality — Enumeration of Escherichia coli and coliform bacteria —Part 1: Membrane filtration method for waters with low bacterial background flora.
- ISO 7218:2007, Microbiology of food and animal feeding stuffs — General requirements and guidance for microbiological examinations Byamukama D., Kansiime F., Mach R.L., Farnleitner A.H. Determination of Escherichia coli. (2) Contamination with Chromocult Coliform Agar Showed a High Level of Discrimination Efficiency for Differing Fecal Pollution Levels in Tropical Waters of Kampala, Uganda. Appl. Environ.
Crediti immagini:
Figura 1: pvl.pt;
Figura 2: labolytic.no;
Crediti tabelle: Scheda Tecnica Condalab.
