Antocianine dai batteri: i pigmenti vegetali hanno una nuova fonte?

Flora, dea romana della fioritura del grano, delle vigne e degli alberi da frutto, innamorata di un giovane di nome di Ciano, ebbe la sventura di ritrovarlo morto, disteso in un campo di cereali punteggiato di stelle azzurre, i fiordalisi. A questo ἄνθος fiore dal colore κύανος blu lapislazzulo, si deve la definizione di antociani (“fiori blu”) ed antocianine, per indicare pigmenti vegetali di fiori e frutti.

Le antocianine fanno parte di un variegato gruppo di composti idrosolubili, noti come flavonoidi, esclusivi del regno vegetale, almeno fino a qualche anno fa. Tali sostanze fitochimiche sono le dirette responsabili dei brillanti colori che le piante regalano ai nostri occhi: rosso, viola, blu, che, in realtà, hanno il compito di attrarre insetti impollinatori ed animali disseminatori. Ma le antocianine hanno anche mostrato proprietà funzionali più sofisticate, sia nell’uomo che negli animali. L’assorbimento dei raggi UV B, l’azione anti-ossidante nella prevenzione di cancro e patologie cardiache, neurodegenerative e diabete, sono solo gli esempi più eclatanti. Qualità così preziose non potevano, dunque, restare relegate in rami, petali e foglie. Coloranti alimentari, prodotti nutraceutici, integratori alimentari, additivi cosmetici, infatti, se ne giovano infatti già da anni.

Le capricciose antocianine vegetali

Più di 650 differenti antocianine sono state identificate da Zhang e colleghi, distinte tra loro da esiti di processi di metilazione, idrossilazione, glicosilazione ed acilazione, con gruppi sia alifatici sia aromatici. Il colore delle antocianine è, infatti, influenzato dal loro grado di acilazione aromatica, dal pH del mezzo, dall’eventuale co-pigmentazione con altri composti fenolici ed in base all’evenienza in cui siano complessate o meno con metalli. Riempiono la gamma degli arancioni, rossi, rosa, fino ai viola ed ai blu (Fig.1).

Le antocianine dei frutti proteggono la salute umana ed animale. — Fig.1 – Il consumo di alimenti ricchi in antocianine promuove la conservazione di un responsivo stato di salute alle variabili ambientali: arance rosse, mirtilli, more, mais e frutti ingegnerizzati ed arricchiti di tali fenoli sono al centro di svariati studi sperimentali.
Petroni et al., Butelli et al..

Il comparto dei coloranti naturali è uno dei settori più floridi dell’industria cosmetica ed alimentare, con un volume d’affari mondiale che si aggira, nelle ultime previsioni per il 2021, sui 4 milioni di dollari. La produzione industriale dei pigmenti naturali si basa principalmente sull’estrazione da piante intere o parti di esse: grappoli guasti di scarto per la vinificazione, carote nere, barbabietole, patate dolci e frutti di bosco. Di recente, inoltre, Ingo Appelhagen e colleghi hanno sperimentato l’estrazione dei composti fenolici da colture di cellule vegetali in sospensione, provenienti da piante di tabacco ingegnerizzato. Il risultato ha regalato il raro blu.

Le antocianine blu, infatti, sono divenute quasi introvabili e l’unica fonte vegetale, pur sempre alternativa, è rappresentata dalla ficocianina dell’alga blu: Arthrospira platensis ovvero la Spirulina.

Dalle difficoltà nascono sorprendenti alternative

La composizione chimica delle antocianine naturali è molto mutevole sia qualitativamente che quantitativamente. Variabili elementari sono la regione d’origine delle fonti naturali e la crescita di queste in balìa della stagionalità. Se a simili incerti si sommano, poi, i continui e laboriosi controlli di qualità, per garantire che gli estratti vegetali abbiano sempre le stesse proprietà cromatiche stabili nel tempo, la ricerca di sintesi alternative non può essere lontana.

Fu così che dal 2005 ad oggi si sperimenta, con un certo insperato margine di resa, la produzione di antocianine da colture microbiche in serie. Tali piattaforme produttive di coloranti naturali si avvalgono di tecnologie di bioprocessing per una produzione su larga scala. La predilezione crescente per i microrganismi si fonda, in realtà, su svariati vantaggi pratici: velocità di crescita e facilità di coltura delle cellule, disponibilità di sofisticati strumenti di ingegneria genetica e di biologia sintetica. Tutto ciò, nell’insieme, rende la produzione microbica di pigmenti naturali più controllabile ed economicamente conveniente.

Batteri e lieviti al servizio dell’industria nutraceutica

La ricerca industriale, attualmente, ha raggiunto la produzione microbiologica di due antocianine comuni, cianidina 3-O-glucoside e pelargonidina 3-O-glucoside, in Escherichia coli, Saccharomyces cerevisiae, Corynebacterium glutamicum e Lactococcus lactis. L’impiego di microrganismi inoltre consente di ottenere le molecole fenoliche a partire da semplice glucosio, senza necessità di arricchimento del mezzo di coltura con altri precursori costosi.

Il primo successo sperimentale nel campo della sintesi microbiologica di antocianine si deve al gruppo di ricerca guidato da Yajun Yan, che ottenne 6.0 mcg/L di cianidina 3-O-glucoside da un ceppo ricombinante di E.coli. In tale studio del 2005 si somministrò al mezzo di coltura naringenina e eriodictiolo, due flavanoni precursori. Nel tempo le rese crebbero fino a toccare valori di 439 mg/L a fronte di 580 mg/L di catechina somministrata al ceppo batterico. Ugualmente efficaci produttori di antocianine, in questo studio, si dimostrarono anche Saccharomyces cerevisiae, Streptomyces venezueleae, Corynebacterium glutamicum, Lactococcus lactis, seppure con rese inferiori.

Da allora si sono succeduti numerosissimi studi di ottimizzazione delle estrazioni fenoliche da cellule batteriche, creando nuovi ceppi ingegnerizzati. Nei batteri ricombinanti è prevista la co-espressione di geni ed enzimi vegetali multipli. Gli enzimi batterici ortologhi, rispetto ai corrispettivi vegetali, hanno sempre manifestato proprietà cinetiche e termodinamiche diverse. Differenze che si sono, poi, confermate anche nella produzione dei composti desiderati. All’interno di questa nuova gamma genetico-enzimatica, i ricercatori hanno selezionato le specie microbiche più efficienti.

Antocianine instabili? La ricerca divide et impera

La natura instabile delle antocianine a pH neutri è una delle maggiori difficoltà di produzione microbiologica di tali composti. Nelle piante, le cianidine sono naturalmente conservate e stabilizzate nei vacuoli, organuli mancanti nelle cellule batteriche. In queste ultime cellule microbiche, inoltre, il pH intracellulare si trova proprio a livelli di neutralità, sconvenienti per la sintesi fenolica. Simili insuperabili ostacoli al raggiungimento di una rapida sintesi industriale hanno ispirato una strategia biocatalitica a due tappe.

Nella prima tappa si ottiene la crescita di E.coli su di un mezzo portato a pH 7, per favorire l’espressione enzimatica e la produzione del co-substrato UDP-glucosio. Nella seconda tappa, invece, le cellule batteriche, con enzimi pienamente espressi, vengono trasferite su un mezzo fresco ed aggiustato a pH 5. Si forniscono, inoltre, precursori così che le antocianine possano essere prodotte e stabilizzate più facilmente. Eventualmente è anche possibile aggiungere ulteriori agenti a funzione protettiva, come il glutammato, che scongiurino la lisi cellulare, ad un pH più basso della neutralità.

Un simile processo a tappe separa, quindi, l’espressione enzimatica dalla sintesi di antocianine. Si raggiunge anche un utilissimo riequilibrio della “pH-dipendenza” tanto del metabolismo primario (crescita cellulare ed espressione enzimatica), quanto di quello secondario (produzione di antocianine). Questa strategia, applicata da Yan e colleghi, ha consentito di registrare un aumento entusiasmante nel titolo della cianidina 3-O-glucoside, di 15 volte superiore (38.9 mg/L) rispetto alla tradizionale estrazione a fase unica (2.5 mg/L) in E.coli.

Le vie di sintesi delle antocianine sono diventate infinite

I consorzi microbici

J. Andrew Jones e colleghi hanno incrementato l’efficacia delle strategie biosintetiche precedenti, allestendo policolture microbiche, detti consorzi microbici, con l’aggiunta di un tipo di Saccharomyces cerevisiae ricombinante. L’intera via biosintetica a partire dal glucosio è estremamente lunga e la divisione del percorso metabolico tra ceppi multipli può alleggerire il carico molecolare e migliorare l’intero processo. Così, i ricercatori hanno scisso la via biosintetica del pelargonidina 3-O-glucoside tra 4 ceppi di E.coli. La reazione iniziale parte dalla tirosina. Lo studio, quindi, ha incluso anche uno stipite ad elevata produzione di tirosina, ottenendo, de novo, circa 10 mg/L di antocianina da 20 g/L di glucosio.

Il deuterio stabilizzante

Mamta Gupta ed il suo gruppo di ricerca si è invece occupato dell’estrazione in forma stabile di uno dei composti fenolici più utili in campo nutraceutico, la cianidina 3-O-glucoside. Il ceppo di E.coli ricombinante è cresciuto in un mezzo caratterizzato da deuterio (D2O) come solvente e glicerolo deuterizzato (D8) come fonte di carbonio. Il batterio ha, così, prodotto cianidina 3-O-glucoside deuterizzata, nutrendosi di catechina. Il composto fenolico deuterizzato è apparso subito più stabile di quello naturale di sintesi. E’ probabile che questo sia dipeso dalla maggiore stabilità dei legami carbonio-deuterio, rispetto a quelli carbonio-idrogeno.

Spontaneità di reazioni indotte

Hulya Akdemir ha guidato un lavoro sperimentale mirato all’estrazione di inusuali rappresentanti della famiglia delle antocianine, le piranoantocianine. Prevalentemente riscontrate nei vini rossi, tali pigmenti derivano dalla condensazione tra antocianine e composti con doppi legami polarizzati: acetaldeide, acido piruvico, acido idrossicinnamico e vinilfenoli. Per produrre piroantocianine, attraverso il metabolismo microbico, è stato ingegnerizzato un ceppo di E.coli, così che esprimesse il 4-vinilfenolo. Ponendo poi il batterio in co-coltura con un produttore di cianidina 3-O-glucoside, i ricercatori hanno ottenuto 19.5 mg/L di piranoantocianidina-3-O-glicoside-4-fenolo. Il tutto non senza ottimizzare contestualmente i parametri di coltura e verificare l’eventuale presenza di etanolo. La sintesi di piranoantocianina, inoltre, si è realizzata anche mediante L. lactis, somministrando catechina per co-produrre cianidina 3-O-glucoside.

Interessante è il dato dal quale emerge come le piranoantocianine siano sintetizzate contemporaneamente dai diversi ceppi in co-coltura. Trapela, dunque, l’ipotesi che si tratti di un processo spontaneo dovuto a potenziale reazione tra cianidina/peonidina ed acido acetico, metabolita di L. lactis. La peonidina non sarebbe altro che cianidina metilata da ignote flavonoidi-metiltransferasi del ceppo L. lactis.

Tutti i regni sono utili, nessuno è indispensabile

La produzione di antocianine colorate grazie a microrganismi ingegnerizzati è una strada molto promettente per sopperire alle carenze delle fonti naturali, quando la richiesta raggiunge ordini di grandezza industriali. Tuttavia, la cinetica degli enzimi ricombinanti, il loro profilo d’espressione genica nonchè la stabilità dei pigmenti di sintesi ottenuti, richiedono ancora approfondimenti e sperimentazioni future. Obiettivo urgente sarà, però, la produzione di antocianine complesse di differenti colori, primo fra tutti lo sfuggente ciano, il primo blu del mito.