Algicida batterico"intelligente": saran fatti salvi i pesci?

E’ difficile non fare di tutta l’erba un fascio, quando si intende colpire la fioritura tossica di alcune specie algali. Sono un mondo variegato ed indecifrabile, le alghe, nell’intero macro-mondo marino. Sempre intrinsecamente connesse ad altre specie, di altri regni, che in mezzo vi nuotano. Ma Deus ex machina, di questo dramma contemporaneo e mondiale, che fa, di innocenti autotrofi, venefiche sovvertitrici dell’ordine delle cose, sarà il batterio Shewanella, ed il suo essudato algicida. O almeno, questo si valuta.

Tutto un fiorire di tossine

Le fioriture d’alga tossica (harmful algal blooms, HABs) sono un fenomeno diffuso in tutto il mondo, i cui accessi crescono in numero ed intensità, tanto da indurre sforzi costanti della comunità scientifica, per farvi fronte. Insieme ad esse, gli oceani si arricchiscono feralmente di una biodiversità nefasta: i molti composti tossici, prodotti da questi agguerriti organismi.

Nel Delaware, in USA, la fioritura della specie Karlodinium venefica, ad esempio, si è resa responsabile della contemporanea liberazione, in acqua, di tossine dagli effetti emolitici, citotossici ed ittiotossici. La loro distruttività, infatti, si esprime mediante creazione di pori nello spessore della membrana, i quali dissipano i più che essenziali gradienti ionici. Con ciò, non tardano, poi, nè lisi cellulare, nè morte delle specie ittiche, finanche invertebrate. Anderson e colleghi hanno proposto, da qualche anno, l’impiego di specie vegetali autoctone e dei loro prodotti, per mitigare tali fioriture e tutti i loro effetti. In quanto composti naturali, armoniosamente arrotondati dalla invisibile mano della Natura, essi promettono di combattere le fioriture indesiderate, con il minor impatto possibile sugli organismi “non-target”.

Jeong e colleghi, infatti, dimostrarono che le sostanze estratte da specie algali avessero, poi, effetto algicida sulle spettacolari maree rosse. Ma, oggi sappiamo, esiste anche un numero crescente di isolati batterici che hanno effetto nocivo su alcune specie di alghe, fino a portarle a lisi e morte cellulare. Inoltre, da opporre all’invasione, vi sono specifici batteri algicidi, con tutti i loro prodotti cellulari.

Unico, doveroso freno ad ipotesi e strategie belliche, per quanto biologiche, la salvaguardia delle altre ignare ed incolpevoli specie dello stesso habitat.

L’algicida di Shewanella: una promessa pericolosa?

Nelle stesse acque del Delaware, alcuni ricercatori, in passato, isolarono un esponente della classe dei Gammaproteobacteria, Shewanella sp. IRI-160. Esso si è, dunque, rivelato in grado di sintetizzare composti algicidi. L’essudato IRI-160, ad esempio, è da considerarsi uno dei migliori algicidi studiati. “Intelligente”, l’IRI-160AA, poichè promette sostanziale innocuità su specie viventi diverse dai dinoflagellati tossici. Nello specifico, la sostanza, impone l’arresto del ciclo cellulare e promuove la morte programmata degli organismi autotrofi.

Su questo provvidenziale prodotto di sintesi batterica, si concentrano, quindi, studi e speranze scientifiche, nell’ottica della sua prossima applicazione sulle acque costiere, in eterna balìa delle fioriture più infelici del mondo vegetale.

Ma, mentre i composti algicidi sono, ormai, pienamente identificati, un approccio integrativo deve chiarire come l’intero essudato batterico possa influire sulle specie non-target. Dopotutto, anche altri stressori naturali ed antropogenici, temperatura, salinità, olii liberi, disperdenti chimici, promuovono effetti letali e sub-letali sugli organismi del bioma in questione. Un primo saggio di mortalità e sub-letalità dell’algicida IRI-160AA, condotto da C. Grasso, presso l’Università del Delaware, ha registrato un declino dei dinoflagellati, mentre la biomassa algale totale restava immutata. Registrazione, questa, ottenuta mediante fluorescenza. Ciò suggerì, quindi, uno shift di comunità del fitoplancton, che colmava il vuoto lasciato dai dinoflagellati.

Però, al di là delle comunità microbiche e di microzooplancton, gli effetti dell’algicida IRI-160AA, sui metazoi, sono ancora nebulosi, per non dire francamente ignoti.

Ittiotossicità dell’algicida batterico: lo studio

Il nuovo studio condotto da Victoria E. Simons ha valutato gli effetti più diretti dell’algicida IRI-160AA sulla vitalità di tre taxa di metazoi marini.

L’Acartia tonsa (Figura 1), un copepode calanoide, dei più abbondanti nel mesozooplancton degli estuari del centro-Atlantico, rappresenta la pastura cruciale, fitoplanctonica, delle larve e dei giovani pesci.

Il granchio blu Callinectus sapidus (Figura 2) è un brachiuro dello stesso habitat centro-Atlantico, almeno nelle fasi giovanile ed adulta, che, però, predilige la placca continentale più interna per trascorrere le prime fasi larvali. Il granchio rappresenta il prodotto di punta del pescato delle zone costiere e del Golfo dell’Oceano Atlantico, quindi l’inclusione nelle prove di tossicità ha una duplice ragione, ecologica ed economica.

Figura 1- Acartia tonsa
Fonte: https://alchetron.com/Acartia-tonsa

Crassostrea virginica (Figura 3) filtra, invece, da ostrica orientale qual è, una gran quantità di acqua marina, e le sue larve possiedono una ridotta selettività predatoria, tra le differenti specie di fitoplancton.

Gli effetti dell'algicida hanno raggiunto anche esemplari di ostriche orientali. — Figura 3 – Crassostrea virginica
Fonte: https://www.google.com/search?q=crassostrea+virginica&client=firefox-b-d&source=lnms&tbm=isch&sa=X&ved=2ahUKEwikve3w4rzuAhUPExQKHZcrD9EQ_AUoAXoECAEQAw&biw=1524&bih=729#imgrc=BQ9jrgWbqE_KdM

Cronache di laboratorio

Proprio secondo il “metodo Grasso”, i ricercatori, nel nuovo studio, hanno trasferito una singola colonia di Shewanella sp. IRI-160 da terreno solido LM modificato a terreno liquido LM modificato, per condurre crescita overnight. Inoculo, poi, con acido casamino 0.05% ed incubazione per 10 giorni, a temperatura ambiente e sotto gorgogliamento.

I batteri ed i relativi composti, di dimensioni superiori a 60kDa, sono stati esclusi per filtrazione con carta per dialisi HemoFlow HF80S. In questo modo, i ricercatori hanno ottenuto un lotto di essudato batterico filtrato, sterile. Alcuni campioni dell’algicida hanno, quindi, subìto diluizione con acqua ultrapura (UPW) e successiva analisi del contenuto di dell’Azoto Totale (TN). Quest’ultimo esame, mediante TOC-V, Analizzatore di Carbonio Organico, ma equipaggiato con unità di misurazione dell’Azoto Totale. Risultato: l’agicida ne possiede 5.02 mg/L.

Saggio di mortalità dell’algicida: EC50 ed LC50

Sulla scorta dell’EC50 nelle 24h di K. veneficum, risultato differente nei vari lotti sperimentali, ma pur sempre intorno all’1%, nei saggi su invertebrati, la concentrazione di algicida è stata applicata all’1%. Tuttavia gli animali hanno anche subìto esposizione ad un terreno di controllo, in modo da esser certi che la mortalità valutata fosse inequivocabilmente ascrivibile all’algicida.

Ben due metodi d’analisi statistica, hanno, inoltre, fatto rigare, nella migliore coerenza sperimentale, i dati registrati: il test di normalità Shapiro-Wilk ed il test di varianza Brown-Forsythe.

Lo studio ha, inoltre, valutato l’azione dell’algicida su differenti fasi ontogeniche dei metazoi: copepode A. tonsa, nauplio ed adulto; granchio C. sapidus, larva zoea e megalopa post-larvale; ostrica C. virginica, larva pediveliger e stadio adulto.

Le prove di mortalità su A. tonsa hanno rivelato che EC50 nelle 24h sia di 13.4% per le femmine adulte e di 5.96% per i precoci naupli. In C. sapidus è del 16% per zoea in prima fase. Meno significativi i dati su megalope ed ostriche.

Tutti i taxa saggiati hanno, inoltre, mostrato valori di LC50 oltre la concentrazione effettiva dell’algicida, resasi necessaria nel controllo della crescita dei dinoflagellati (EC50 circa 1% v/v). E per la maggior parte degli stessi taxa, LC50 è corrisposto, invece, ad un valore 10 volte superiore a quello di EC50 dei dinoflagellati.

Esiti di sensibilità dei metazoi all’algicida

Gli individui più sensibili, all’interno di specie e di stadio di sviluppo, si dimostrano i copepodi naupli di A. tonsa, con LC50 ben 5 volte superiore ad EC50 dei dinoflagellati. Per il resto, i trattamenti all’1% hanno garantito una sopravvivenza molto elevata, nell’arco delle 24h, in tutti i taxa, con più dell’85% di sopravvivenza. E nessuna differenza significativa nei relativi controlli sperimentali.

In generale, i saggi di mortalità di questo lavoro rivelano una prevedibile sensibilità accentuata degli stadi più precoci di accrescimento metazoico, all’algicida. Simili effetti, in rapporto allo stadio di accrescimento e di dimensione corporea, o, meglio, al rapporto area di superficie/volume, si riscontrano a causa di altri contaminanti ed interferenti. Pesticidi, disperdenti chimici e metalli, d’altronde, sono incerti ambientali incidentalmente costanti, ormai.

Gli individui adulti, quindi, grazie alle proprie strutture ed a ben acquisite abilità, possono meglio controllare la propria esposizione tissutale a tutti i tossici ambientali. Con tale comportamento, i ricercatori giustificano la maggiore resistenza all’algicida nelle 24h, delle ostriche allo stadio di pediveliger, rispetto a stadi di sviluppo minori.

Effetti sub-letali dell’algicida

Oltre alla mortalità, però, gli stressori possono, in genere, incidere anche sul livello di attività e sulla fisiologia dei metazoi, come di organismi marini superiori. Sia in senso positivo che negativo. In quest’ultimo studio, i risultati di mortalità informano, dunque, gli operatori, di una maggiore vulnerabilità dei copepodi, rispetto ai granchi allo stadio di zoea e delle ostriche pediveliger. Tuttavia, anche gli effetti sub-letali dell’algicida, risultano più evidenti in queste due ultime tipologie, rispetto ai copepodi.

Le percentuali respiratorie crescono nei copepodi naupli, in trattamento all’11%, ed in fase di zoea di granchio, trattamenti all’11% e al 17%. Nell fasi di sviluppo più tarde e nelle ostriche, nulla, invece, cambia. Le femmine adulte di copepodi, addirittura, non mostrano alcuna alterazione dei livelli respiratorii, ad alcuna concentrazione dell’algicida. Lo stesso dicasi per i livelli d’attività valutati.

I livelli di attività cambiano in zoea di granchio, in trattamenti algicidi di 1%, 11%, 17%, ed in larve pediveliger d’ostrica, in trattamenti al 17%. Ancora, nei copepodi adulti, il livello d’attività non subisce alcuna modifica. E, nonostante i copepodi naupli non siano stati inclusi nei saggi di attività a causa delle dimensioni eccessivamente ridotte, il loro tasso respiratorio è pur risultato, in trattamenti all’11%. E tali concentrazione è ben oltre qualla calcolata in LC50 al 6%.

Periodicità fisiologica e comportamento

I saggi di mortalità e sub-letalità dell’algicida, dai ricercatori sono stati, poi, correlati anche alle fasi di luce e di buio. Il granchio in stadio di zoea, in fase di luce, nuota per restare nelle acque superficiali, e spostarsi dall’estuario all’oceano costiero; così non c’è da attendersi alcun effetto in fase di luce. Quando i ricercatori hanno distinto l’attività per fase di luce, l’incremento d’attività dovuta all’algicida risulta nelle prima fase di luce. Nessuna evidente differenza, con alcun trattamento, rispetto al controllo, in fase di buio ed in tarda fase di luce.

Nella prima fase di luce, le larve pediveliger di ostriche mostrano attività drasticamente ridotta, nel trattamento LAM al 17% (Locomotor Activity Monitor in acqua pulita) e, come per le larve di granchio, tale risposta scompare nella seconda fase di luce e nelle fase di buio. Quando i ricercatori hanno valutato, in corso di esposizione all’algicida, l’attività delle ostriche, essa è risultata ridotta anche del 10%. Di fatto, in entrambi i saggi, le ostriche si trovano a valve chiuse, ed anche comprensibilmente. L’obiettivo dei molluschi è, come detto, isolare i propri tessuti dal prodotto batterico, o almeno ridurne l’esposizione.

Algicida biocompatibile: un ragionevole obiettivo

Gli effetti di mortalità e sub-letalità, quando innegabili, tuttavia intaccano solo le forme di vita più piccole e giovani, dice lo studio. E dice pure che gli effetti dell’algicida testato siano minime o assenti, alle concentrazioni strettamente necessarie allo scopo.

I futuri modelli sperimentali, dunque, sulla scorta di tali risultati, dovranno valutare specificatamente i tempi di persistenza in acqua del prodotto batterico, poichè dai tempi e modi d’esposizione della micro- e macro-fauna ittica dipenderà la calibrazione degli interventi anti tossicità algale. E forse, anche vagliare e verificare esposizioni simultanee di dinoflagellati e metazoi, all’algicida. Ma quasta è un’altra storia.