Principio
Perchè si coltivano i virus?
La coltivazione e la titolazione virale sono utili per diversi motivi:
- Diagnosi di un’infezione
- Ricerca
- Produzione di vaccini
Prima cosa da tenere presente per la coltivazione e titolazione virale, è che i virus in generale non possono replicarsi fuori dalle cellule. Sono parassiti endocellulari obbligati.
In laboratorio, la coltivazione dei virus può essere eseguita tramite:
- Modelli animali
- Uova embrionate
- Colture cellulari: crescita in vitro di cellule non più organizzate in tessuto.
Le cellule utilizzate in laboratorio devono avere due caratteristiche principali:
- Sensibilità: la cellula deve esprimere un adeguato recettore.
- Permissività: la cellula permissiva può supportare la crescita del virus.
Inoltre, le colture cellulari utilizzate in laboratorio possono essere:
- Cellule primarie: prelevate da un tessuto, hanno ridotta capacità di dividersi e dopo qualche passaggio vanno incontro a morte cellulare.
- Cellule diploidi.
- Linee cellulari continue: crescono in modo indefinito (esempio: linea cellulare HeLa).
Che cos’è il saggio delle placche?
Il saggio delle placche è un metodo quantitativo, utilizza le colture cellulari e permette di contare il numero di particelle virali presenti in soluzione.
Si basa sull’effetto citopatico che è un’alterazione della morfologia cellulare provocata dal virus e che porta alla morte cellulare.
Alcuni virus provocano la fusione delle cellule contigue (la fusione delle membrane cellulari) e si formano i cosiddetti sincizi.
Metodo
Il metodo è stato sviluppato dal biologo e medico Renato Dulbecco e dalla sua assistente la dott.ssa Marguerite Vogt prima per analizzare i fagi, e poi per studiare e approfondire le proprietà biologiche del virus della poliomielite.
Ciclo replicativo virale
I virus hanno sviluppato numerose strategie per moltiplicarsi all’interno delle cellule. Sebbene i dettagli siano diversi da un gruppo all’altro, le linee generali dei cicli di replicazione sono simili. Le tappe principali sono le seguenti:
- Attacco del virus alla cellula, penetrazione e denudamento
- Espressione dei genomi virali e sintesi dei componenti virali nella cellula
- Rilascio della progenie virale al di fuori della cellula
Il virus aderisce grazie ai recettori presenti sulla cellula e inizia così il ciclo replicativo virale dentro la cellula infettata. A seguito dell’infezione, uno degli effetti è quello citopatico.
In laboratorio, esecuzione del saggio delle placche
Si utilizzano colture cellulari aderenti in strutture in polistirene: le cellule crescono in monostrato, adese alla plastica, con il terreno di coltura aggiunto in tutti i pozzetti contenenti le cellule. I terreni per coltura cellulare sono complesse combinazioni di sali, carboidrati, vitamine, aminoacidi, precursori metabolici, fattori di crescita, ormoni e oligoelementi.
A seguito di incubazione per 24 ore, viene rimosso il terreno liquido e le cellule adese sono pronte per essere infettate dal virus in soluzione che si vuole quantificare.
Le cellule infettate vengono incubate a 34 – 37°C e al 5% di CO2. Il tempo che passa dall’infezione alla lettura del risultato dipende dal ciclo di replicazione del virus che può variare da pochi giorni (per esempio, Poliovirus) a 2 o più settimane (per esempio, alcuni Paramyxovirus).
Durante l’incubazione, le cellule infettate vanno incontro a morte cellulare e si staccano dalla base andando a finire nel terreno superficiale. Si generano dei veri e propri spazi all’interno della coltura, dovuti dall’effetto citopatico.
Successivamente i passaggi previsti sono i seguenti: rimozione del terreno, fissazione e colorazione delle colture cellulari infettate con Cristal Violetto (esistono anche altri metodi di colorazione), e lavaggio con acqua.
Risultati attesi
A questo punto, è possibile vedere ad occhio nudo dei veri e propri “buchi” all’interno della coltura cellulare, provocati dalle particelle virali. I “buchi” sono chiamati placche virali, utili per quantificare il virus come Unità Formanti Placca (PFU) per millilitro (ml). Le placche vengono conteggiate macroscopicamente dall’operatore.
Il metodo si basa sul fatto che maggiore è il numero di particelle virali inoculate e numerose saranno le placche presenti.
Teoricamente, se ogni virus presente nel volume (V) di soluzione infettasse una sola cellula, basterebbe contare il numero di placche (N) per conoscere il numero di particelle virali presenti (C), e ricavare facilmente la concentrazione virale secondo la formula seguente:
C = N / V
Limitazioni del test
In realtà, può capitare che più particelle virali infettino la stessa cellula nel saggio delle placche. Per ridurre il più possibile il problema, vengono utilizzati due accorgimenti:
- Diluizione della concentrazione virale, le diluizioni eseguite devono essere considerate nel calcolo finale del n° di particelle virali.
- Utilizzo di sostanze gelificanti, solitamente agar, aggiunte alla coltura cellulare che la rendono semi solida e impediscono alla nuove particelle virali di infettare cellule molto lontane. Le particelle virali infettano solo le cellule contigue: questa è la cosiddetta citopatizzazione discreta.
Inoltre, il saggio delle placche può essere utilizzato solo quando il virus inoculato provoca l’effetto citopatico, e non tutti i virus hanno questa caratteristica. Infatti esistono anche altri metodi per la coltivazione e la titolazione dei virus (esempio: test di emoagglutinazione)
Quality control
Possibili cause di contaminazione:
- Errore dell’operatore
- Terreni o reagenti contaminati da batteri, virus, funghi
- Cappa a flusso laminare non funzionante
- Incubatore contaminato
- Conservazione in azoto liquido di materiale contaminato
Precauzioni per la prevenzione delle contaminazioni:
- I terreni e le soluzioni che si usano devono essere sterili
- Aggiungere antibiotici e antimicotici quali penicillina-streptomicina-anfotericina B
- Destinare il laboratorio solo alle colture cellulari
- Operare sempre sotto cappa a flusso laminare
- Utilizzare solo materiale sterile (di vetro o di plastica)
- Utilizzare sempre pipettatori elettrici
- Pulire e sterilizzare mediante UV la cappa a inizio e fine lavoro
- Controllare periodicamente i filtri della cappa
- Mantenere pulito l’incubatore e impostato alla temperatura idonea
Fonti
- Science direct
- https://it.m.wikipedia.org/wiki/Titolazione_virale
- microbeonline.com
- Dispense di Virologia Ambientale
- Jawetz, Melnick, Adelberg’s Microbiologia Medica XXVII Edizione. Piccin Nuova Libraria s.p.a. ISBN 978-88-299-2872-9.
Crediti delle immagini
- Immagine in evidenza: Flickr.com
- Figura 1: Wikipedia.org
