Sappiamo bene che la PCR è una delle più note e diffuse tecniche di amplificazione di porzioni geniche di DNA. Il funzionamento di questa tecnica, nota per la grande efficacia e ripetibilità nei confronti di una enorme varietà di campioni, è dovuta ai cambiamenti nel tempo di un parametro misurabile come la temperatura. Infatti, le oscillazioni climatiche permettono le fasi di denaturazione, appaiamento (annealing) e allungamento che ci consentono quindi di ottenere DNA amplificati digeribili con enzimi o misurabili tal quali. I cambiamenti di temperatura sono resi possibili grazie al termociclatore, strumento di fondamentale importanza nei laboratori di microbiologia e biotecnologie microbiche, oggi prodotto da diverse aziende con differenti punti a favore o a sfavore in base alla ditta produttrice.
Funzionamento
Volendo adottare una visione d’insieme, possiamo affermare che il termociclatore è un blocco termico in cui vi sono inserti per i campioni, solitamente provette eppendorf. Questo blocco funziona in base ad un sistema in grado di riscaldare e raffreddare automaticamente, senza imput esterni ad eccezione dell’avviamento; ciò è possibile grazie ad un algoritmo imponibile e memorizzabile con l’aiuto di un software, all’inizio del ciclo, su schermi a cristalli liquidi dotati di tasti, oppure touch screen nelle versioni più aggiornate. Alcuni modelli possono contenere una compartimentazione termica all’interno, con lo scopo di effettuare il medesimo ciclo a differenti campioni con una determinata coppia di oligonucleotidi (primers) ma con temperature di annealing differenti, nonché un sistema anticondensa mediante l’applicazione di una pressione sui tappi delle provette.
I moderni termociclatori possono, inoltre, essere dotati di stampante associata nonché di sofisticati sistemi di rilevazione con elevata sensitività fotoelettrica e con tecnologia di scansione laterale; il risultato si traduce in una notevole accuratezza e precisione dello strumento. Tra l’altro, i termociclatori possono funzionare real-time oppure consentire l’associazione di moduli esterni per lo svolgimento di questa funzione.
Caratteristiche importanti
L’amplificazione di sequenze di DNA trova applicazioni vastissime, per cui le esigenze di tecnici di laboratorio ed esperti del settore sono molteplici. A tale scopo, numerose risultano essere le offerte che pervengono da aziende specializzate nella vendita e assistenza di strumenti professionali come, appunto, i termociclatori. Elencheremo quindi una serie di parametri importanti da tenere d’occhio in fase di acquisto.
- Accuratezza e riproducibilità: l’aspetto fondamentale di uno strumento è la sua accuratezza. In questo caso, il parametro cruciale da tenere sotto controllo è la temperatura, per cui per avere la certezza che venga amplificata solo la sequenza corretta è fondamentale che si raggiunga solo la temperatura prestabilita. Temperature non desiderate o raggiunte in tempi non omogeni possono portare a risultati non esatti, nonché ad una inattivazione della Taq polimerasi (nei casi più gravi).
- Uniformità della temperatura: i pozzetti devono sempre essere alla stessa temperatura, ragion per cui alcuni fornitori propongono l’uso di sonde da inserire appositamente nel blocco termico.
- Velocità: parametro fondamentale, associabile (ma differente) all’accuratezza del sistema di riscaldamento, poiché la velocità di riscaldamento del termociclatore, dichiarata dai fornitori come velocità di “ramping” per il blocco vuoto, non è mai identica a quella di un vano contenente provette con i reagenti, magari molto fredde a causa dell’uso di enzimi e primers appena scongelati. Fondamentale anche il monitoraggio della velocità di raffreddamento, fattore determinante nei sistemi moderni a tecnologia Peltier.
- Semplicità di utilizzo e adattabilità: lo strumento può essere utilizzato da diversi operatori, con comprovata esperienza o alle prime armi, per cui modalità operative e logiche intuitive faciliterà il compito e assicurerà risultati accurati e riproducibili. Inoltre, è raccomandabile l’uso di termociclatori compatibili con tutte le plastiche e le chimiche presenti in commercio, onde evitare l’acquisto di ulteriore materiale dedicato.
- Affidabilità del fornitore: ultima ma non meno importante, è la caratteristica sulla quale ogni strumento andrebbe valutato. Molti termociclatori possiedono algoritmi di autodiagnosi, e peraltro è facile districarsi sul web per reperire dritte e informazioni, ma il parere tecnico dell’azienda che fornisce il prodotto a volte è davvero insostituibile.
- Dimensioni: i termociclatori da PCR Real Time sono solitamente più ingombranti di quelli classici, ma in genere le dimensioni oscillano tra 25x35x25 cm. E’ fondamentale scegliere bene, in particolare in fase di allestimento di piccoli laboratori presenti in realtà aziendali come cantine o caseifici, anche facendo riferimento al numero di pozzetti utili per singola analisi.
- Costi: le aziende produttrici hanno sviluppato numerosi modelli, per cui la scelta potrebbe essere difficile in particolare per chi non è in possesso di esperienza o conoscenza approfondita del mercato. Ancora una volta l’affidabilità del fornitore è fondamentale; inoltre, la possibilità di inserire nel preventivo kit e assistenza da remoto a volte può essere estremamente conveniente, soprattutto se consideriamo che i prezzi partono dai 2000 euro fino ad arrivare a 10-12000 euro o anche più per termociclatori real time.
