Di ratti ad Hong Kong ed epatiti E: una nuova zoonosi?

Una nuova zoonosi

Negli ultimi anni, una nuova zoonosi si è diffusa in alcune zone del mondo causando epatiti virali con manifestazioni di inappetenza, malessere, nausea, febbre e ittero.

Epatite E

Questa infezione è detta epatite E (HEV) ed è causata da un virus a RNA e solitamente trasmessa per via oro-fecale. La variegata famiglia degli Hepeviridae, che incorpora tutte le varianti di HEV, comprende membri che come ospiti primari hanno i mammiferi terrestri (Orthohepevirus) e membri che come ospiti primari prediligono i pesci (Piscihepevirus). Il genere Orthohepevirus è classificato in 4 specie: tutte le varianti del virus dell’epatite E (HEV) capaci di infettare l’uomo appartengono alla specie Orthohepevirus-A (HEV-A), di cui esistono 5 genotipi (HEV-G1/G2/G3/G4/G7) in grado di causare epatite nell’uomo, e dei quali i genotipi 3 e 4 sono responsabili di una trasmissione zoologica per via alimentare, mentre il genotipo 7 è di recente identificazione in un paziente degli Emirati Arabi Uniti ricevente un trapianto di fegato per epatite E cronica.

Le altre specie del genere Orthohepevirus comprendono l’Orthohepevirus B che circola nei polli, l’Orthohepevirus C che infetta i ratti e l’Orthohepevirus D che si ritrova nei pipistrelli.

Figura 1 - Virus dell'epatite E (HEV) — *Figura 1 – Virus dell’epatite E* *(HEV)*

Il genoma

Il genoma ad RNA del virus contiene tre ORF (open reading frame), fra le quali ORF-1 codificante per una poliproteina non strutturale multifunzionale contenente un dominio metiltransferasico, e geni codificanti per RNA-polimerasi RNA-dipendenti, usati spesso per la tipizzazione molecolare. I diversi genotipi del virus dell’epatite E possono causare epidemie trasmesse attraverso la contaminazione fecale dell’acqua o la via oro-fecale da persona a persona. Queste epidemie hanno caratteristiche epidemiologiche simili alle epidemie di epatite A. I principali focolai sono stati riscontrati in Cina, India, Messico, Pakistan, Perù, Russia e Africa settentrionale e centrale. In territori come gli Stati Uniti e l’Europa, invece, non sono stati riscontrati casi se non in persone di ritorno da Paesi in via di sviluppo. Altri genotipi possono portare all’insorgenza di casi sporadici e prediligere la trasmissione per via alimentare attraverso il consumo di carne cruda o poco cotta di animali come cervi, maiali e frutti di mare.

L’epatite cronica o la cirrosi sono state riscontrate solo in pazienti immunocompromessi (che hanno subito trapianti d’organo, chemioterapia o affetti da AIDS). L’epatite fulminante o la morte sono rare tranne che durante una gravidanza.

Figura 2 - Genoma dell'HEV — *Figura 2 – Genoma dell’HEV*

La diagnosi

Solitamente, la diagnosi di epatite E viene fatta escludendo l’infezione da epatite A, B o C in presenza di sintomi tipicamente associati all’epatite acuta, in pazienti di ritorno da aree endemiche. Per lo screening del virus dell’epatite A, B e C si eseguono test come il dosaggio gli anticorpi IgM contro il virus dell’epatite A, il dosaggio degli anticorpi IgM anti-core dell’epatite B (IgM anti-HBc), il dosaggio dell’antigene di superficie dell’epatite B (HBsAg) e il dosaggio degli anticorpi anti-HCV; inoltre, viene fatta una PCR (polymerase chain-reaction) dell’RNA del virus dell’epatite C (HCV-RNA). Se tutti questi test risultano negativi è disponibile il test degli anticorpi IgM anti-HEV. Nei pazienti affetti da epatite E cronica è consigliato il trattamento con ribavirina, mentre nei pazienti affetti da epatite acuta non ci sono farmaci in grado di attenuare la patologia. Non è consigliato l’isolamento dei pazienti affetti in quanto, in buone condizioni igieniche, è altamente improbabile la trasmissione interumana.

È disponibile in Cina il vaccino per l’epatite E con un’efficacia del 95% nel prevenire l’infezione sintomatica nei maschi mentre in altri gruppi, la durata della protezione e l’efficacia della prevenzione sono sconosciute.

In uno studio del 2018 è riportato un caso di un uomo di 56 anni di Hong Kong che in seguito ad un trapianto di fegato mostrava delle anomalie epatiche senza una causa apparente. Sono stati eseguiti vari test che hanno sottolineato la responsività del suo sistema immunitario al virus dell’epatite E anche se non è stato riscontrato nel sangue il virus dell’epatite E umano. Riprogettando il test diagnostico, i ricercatori hanno evidenziato, per la prima volta nella storia, il virus dell’epatite E di ratto in un essere umano.

L’HEV-C condivide solo il 50-60% del suo genoma con HEV-A. Il potenziale zoonotico del virus del ratto non è noto e la sostanziale divergenza filogenetica fra HEV-C e HEV-A, specialmente a livello dei domini di legame di recettori critici, costituisce una teorica barriera per la specie. Inoltre, i test sierologici e molecolari progettati per rilevare principalmente HEV-A potrebbero non rilevare HEV-C, quindi è necessario mettere a punto test specifici per HEV-C.

I casi di Hong Kong

L’infezione, scoperta dal dr. Siddharth Sridhar, è stata definita insolita e senza precedenti tanto che inizialmente gli scienziati hanno pensato ad un incidente casuale. Invece, da quel primo studio, in poco tempo sono stati identificati altri 10 casi ad Hong Kong e si pensa che nella popolazione potrebbero esserci centinaia di persone infette e non diagnosticate. Le modalità di trasmissione del ceppo murino di epatite E sono ignote e il Centro per la protezione della salute (CHP) di Hong Kong ha decretato che, sulla base delle informazioni epidemiologiche, la fonte dell’infezione non è stata ancora determinata. Tuttavia, i test diagnostici sono stati perfezionati e nella città sono state avviate campagne di sensibilizzazione pubblica.

Gli scienziati si sono, inoltre, adoperati per identificare il cluster all’interno della popolazione di ratti e questo ha fornito informazioni sul numero di roditori portatori di HEV e sulle aree che ospitano il maggior numero di ratti. Purtroppo, il periodo di incubazione è ancora ignoto e non si è ancora scoperto un trattamento efficace poiché i farmaci utilizzati contro l’epatite E umana hanno fornito risultati contrastanti nei confronti dell’epatite E di ratto.

Non sapere come il virus venga trasmesso dai ratti all’uomo rende molto difficile dare un senso ai dati raccolti e ostacola la prevenzione.

Il dr. Sridhar, in questo studio, esorta tutti i Paesi a sviluppare dei test per la diagnosi di HEV di ratto poiché la mancanza di consapevolezza da parte dei medici e una diagnosi scarsamente standardizzata potrebbero portare ad una segnalazione inefficiente e, quindi, alla diffusione rapida del virus.

Lo studio portato avanti da Tian-Cheng Li si è occupato di studiare la suscettibilità dei ratti ai genotipi umani di HEV. Infatti, sebbene i ratti siano da tempo sospettati di essere un potenziale serbatoio di HEV umano, non è stata trovata ancora nessuna prova diretta.

Quattro genotipi HEV (1–4) sono stati isolati dall’uomo (1: Africa e Asia, 2: Messico e Africa occidentale, 3: Paesi occidentali, 4: Cina, Taiwan, Giappone). Di questi, il 3 e il 4 sono stati isolati anche da maiali, cinghiali, cervi e manguste e si ritiene che questi animali siano possibili serbatoi del virus. Prove dirette hanno indicato che l’HEV viene trasmesso da suini o cinghiali all’uomo; pertanto, l’epatite E causata dall’infezione dai genotipi 3 e 4 di HEV è riconosciuta come zoonosi. Tuttavia, la suscettibilità dei ratti al virus umano è controversa.

Infatti, IgG anti-HEV sono stati rilevati in varie specie di ratti, tra cui ratti norvegesi (Rattus norvegicus), ratti neri (Rattus rattus) e ratti del cotone (Sigmodon hispidus), utilizzando ELISA con antigeni derivati da G1 HEV. Questi risultati suggeriscono che nei ratti selvatici si verificano infezioni da virus HEV o simile a HEV. Inoltre, recentemente, Lack et al. hanno isolato ceppi di G3-HEV da una varietà di ratti negli Stati Uniti e questo potrebbe far pensare che i topi selvatici sono possibili ospiti di HEV umana. Tuttavia, il genoma del virus, nel ratto, non è stato rilevato e la fonte dell’infezione è stata confermata in pochi casi. Perciò non è chiaro se le IgG anti-HEV siano state indotte da HEV o altri virus simili a HEV.

L’esperimento sui ratti

Per studiare ulteriormente la potenziale suscettibilità dei ratti alle infezioni con HEV umano, il genotipo 3 è stato iniettato e ne è stata monitorata la crescita all’interno di ratti nudi. In questo studio, sono state utilizzate sei femmine di ratto di 15 settimane.

Questi ratti, che sono allevati per essere immunodeficienti (con timo assente o non funzionale), sono noti per essere suscettibili all’HEV di ratto, ma non sono noti per la loro parassitosi ad altri tipi di HEV.

I sei ratti sono stati assegnati in modo casuale a due gruppi, iniettati per via endovenosa con 500 μL di una sospensione di campione HEV attraverso la vena della coda e monitorati per tre mesi. I tre ratti nel gruppo 1 sono stati iniettati con il campione derivato da feci di maiale, mentre i tre ratti nel gruppo 2 sono stati iniettati con il campione di surnatante di coltura cellulare di epatocarcinoma. In seguito all’esame di RT-PCR nidificata e al test ELISA, è emersa la negatività di tutti gli animali al virus G3-HEV e la mancanza di IgG e IgM anti-HEV. Il siero è stato utilizzato anche per valutare i valori di alanina aminotransferasi (ALT) che non ha subito variazioni significative.

Perciò, questo studio ha concluso che non ci sono prove che i ratti siano sensibili all’infezione da G3-HEV.

Altri studi

Un altro studio si è occupato di un paziente che ha subito un trapianto di fegato con conseguente epatite causata dall’infezione da HEV-C. È stato rielevato l’RNA del virus in molti campioni clinici e l’antigene HEV-C nel fegato. Il paziente presentava, inoltre, anticorpi per HEV preesistenti che, tuttavia, non sono risultati protettivi nei confronti dell’infezione da HEV-C. Il trattamento con ribavirina è stato efficace con conseguente risoluzione dell’epatite e clearance della viremia.

Lo studio ha preso in considerazione 518 pazienti sottoposti a trapianto di organi solidi (rene, fegato, polmone, cuore), dei quali 52 (il 10.2%) presentavano la sintomatologia di una epatite persistente e fra questi, 5 sono risultati positivi a HEV. L’epatite persistente è stata definita come un aumento, fino a 1.5 volte maggiore il limite superiore, dell’enzima alanina ammino-transferasi (ALT) per un periodo continuo che supera le 6 settimane.

Nei pazienti che presentavano questa condizione sono stati valutati i risultati degli ultrasonogrammi, delle colangiopancreatografie retrograde endoscopiche e i risultati di laboratorio riguardanti la detection del virus dell’epatite C o B (HCV o HBV) o del citomegalovirus (CMV), al fine di identificare la probabile causa di epatite. Laddove non è stato possibile identificare la causa, è stato eseguito un test di screening ELISA per IgM-HEV. Solo i pazienti con test ELISA positivo e infezione persistente per più di tre mesi sono stati classificati come positivi all’HEV del ratto. Con la finalità di rilevare l’acido nucleico del virus HEV-C e sequenziare il suo genoma, sono state progettate 3 PCR (polymerase chain-reaction) basate sulla trascrizione inversa (RT-PCR) per rilevare HEV (ceppo LCK-3110) nei campioni fecali dei pazienti. I primer utilizzati per l’amplificazione sono stati progettati mediante l’allineamento multiplo di genomi di HEV-C di ratto in GenBank. Gli studiosi si sono, infatti, accorti che il test disponibile per HEV-A non poteva essere applicato per la diagnosi di HEV-C.

Dei 5 pazienti positivi, i quattro che hanno subito un trapianto di rene sono poi risultati quasi tutti positivi a HEV-A mentre l’unico paziente sottoposto al trapianto di fegato è risultato positivo all’HEV-C di ratto. Nel paziente positivo, i test di funzionalità epatica, eseguiti post-trapianto, sono risultati normali perciò è stato dimesso con una terapia immunosoppressiva che comprendeva micofenolato miofetile, tacrolimus e prednisolone per la profilassi, e entecavir per monitorare l’infezione da HBV. Poco tempo dopo è stato rilevato un leggero aumento dell’enzima ALT, seguito da un aumento dell’aspartato ammino-transferasi (AST) e della gamma-glutammil-transferasi (GGT), mentre la fosfatasi alcalina (ALP) risultava normale. È stata inoltre osservata una leggera linfopenia.

L’RNA HEV-C nei campioni del paziente è stato rilevato soltanto 43 giorni dopo il trapianto in un campione di siero (ma è stato rilevato anche in campioni di feci, saliva e nel tessuto epatico). È stato osservato che il declassamento dell’enzima ALT era correlato con l’aumento del carico di RNA HEV-C mediante regressione lineare. La terapia immunosoppressiva e i farmaci contro la viremia da CMV non hanno funzionato (si pensa che l’immunosoppressione abbia favorito l’infezione come è riportato anche in studi sull’Aviaria), e nella biopsia epatica si potevano osservare molti infiltrati infiammatori di intensità lieve o moderata. Perciò, escluse le infezioni da HBV, HCV, HAV, CMV, è stata sospettata un’infezione persistente da HEV. Grazie ad una RT-PCR in grado di rilevare tutte le specie del genere Orthohepevirus sono stati rilevati ampliconi nel siero, nelle feci e nel tessuto apatico e il sequenziamento ha confermato il sospetto di infezione da HEV-C. Il trattamento con ribavirina orale è stato risolutivo portando alla normalizzazione dei valori di ALT e alla diminuzione, fino a livelli non rilevabili, di RNA HEV-C.

Per caratterizzare la risposta sierologica è stato eseguito un Western-blot usando proteine ricombinanti purificate di HEV-A e HEV-C ottenute mediante l’amplificazione (con l’utilizzo di primer specifici) dei geni che codificano per i peptidi ricombinanti immunogenici di HEV-A e HEV-C, il loro clonaggio in un vettore di espressione batterica e l’espressione in E. coli.

Sono stati utilizzati due anticorpi contro HEV-A (anticorpi monoclonali murini – mAbs – contro l’antigene ORF-2 di HEV-A): uno ha prodotto una “macchia” HEV-A IgG ma non in HEV-C confermando la specificità per HEV-A; l’altro ha mostrato invece cross-reattività contro HEV-A e HEV-C. Inoltre, è stata aumentata l’espressione di anticorpi policlonali contro la proteina ricombinante HEV-C nei topi e il siero policlonale murino ha reagito in entrambe le “macchie” dimostrando la sua cross-reattività. Lo stesso si è osservato per il siero del paziente prelevato circa 100 giorni dopo il trapianto.

Per studiare se le linee cellulari umane potrebbero supportare la crescita di HEV-C, sono state selezionate le linee cellulari A549 (adenocarcinoma polmonare), Huh-7 (carcinoma epato-cellulare) e Caco-2 (adenocarcinoma colon-rettale). I supernatanti e i lisati sono stati sottoposti a RT-PCR quantitativa HEV-C (qRT-PCR) e immunocolorazione.

L’RNA HEV-C è stato rilevato in tutte e tre le linee cellulari, in quantità maggiore nei lisati rispetto ai supernatanti, suggerendo un’infezione efficace.

È stata condotta una colorazione immunoistochimica di sezioni di tessuto epatico fissate in paraffina o formalina e monostrati di colture cellulari A549 infette, utilizzando anticorpi sierici policlonali HEV-C e mAb HEV-A. Inoltre, la colorazione immunofluorescente di cellule infette permeabilizzate utilizzando l’antisiero policlonale HEV-C ha confermato la presenza dell’antigene citoplasmatico HEV ORF-2.

Questi risultati hanno suggerito la presenza di una replicazione virale abortiva di HEV-C nelle linee cellulari umane.

Indagini epidemiologiche

Sono state portate avanti anche indagini epidemiologiche ambientali sia attraverso il controllo del siero dei donatori (con test ELISA, Western-blot e RT-PCR), sia attraverso il monitoraggio dei campioni ottenuti in un’area limitrofa a quella di residenza del paziente infetto.

L’unità abitativa del paziente era situata nelle vicinanze di uno scivolo per i rifiuti dove sono stati prelevati dei campioni fecali di ratto. Tuttavia, tutte le rilevazioni effettuate sono risultate negative per HEV-C. Per ampliare l’indagine sono stati recuperati dei campioni archiviati di roditori raccolti attorno all’area di residenza del paziente e sono stati sottoposti a RT-PCR. Grazie a quest’analisi è stato possibile ricostruire degli alberi filogenetici riguardanti le sequenze nucleotidiche dei vari ceppi di HEV scoprendo che il ceppo LCK-3110, identificato nelle feci dei pazienti, condivide il 93.7% di identità con il ceppo Vietnam-105. I risultati di questo studio pionieristico confermano quindi che HEV-C è in grado di infettare l’uomo causando delle malattie clinicamente significative e che è necessario rivalutare l’importanza di zoonosi come questa in pazienti immunocompromessi o immunocompotenti ma con epatite ad eziologia sconosciuta.

Saranno necessari studi futuri incentrati sulle differenze nel potenziale zoonotico fra i vari ceppi di HEV-C e volti a chiarire come la trasmissione inter-specie possa essere avvenuta e con quale frequenza. Sarà necessario, inoltre, scoprire l’esatta via di trasmissione di questa tipologia di epatite che per adesso, secondo alcune ipotesi, potrebbe essere trasmessa per via alimentare o da donatore affetto. Ancora, sarà di fondamentale importanza mettere a punto test efficaci, standardizzati e specifici per i vari ceppi di HEV-C in modo che si possano eseguire donazioni di sangue e organi in sicurezza.

Un altro studio si è occupato di determinare i serbatoi del virus dell’epatite E animale analizzando marcatori sierologici e molecolari dell’infezione HEV tra gli animali selvatici in Germania. In particolare, sono stati rilevati ceppi del genotipo 3 di HEV negli organi interni e nei tessuti muscolari di cinghiali e cervi, indicando un alto rischio di infezione alimentare nell’uomo.

Durante due stagioni di caccia sono stati ottenuti 339 campioni sierologici da cinghiali, caprioli, cervi e daini e questi sono stati analizzati mediante test ELISA per IgG specifiche per HEV. Sono stati rilevati 81 campioni positivi, in particolare nella popolazione dei cinghiali dove è stato registrato un aumento della percentuale di casi positivi in entrambe le stagioni di caccia.

Tutti i campioni nella popolazione dei cervi selvatici sono risultati negativi ma ci sono stati 3 casi di positività in una popolazione di cervi proveniente da un’altra area di caccia. Inoltre, sono stati testati campioni di fegato e siero di 415 animali per il genoma HEV, utilizzando RT-PCR real time. L’RNA di HEV è stato rilevato in 46 animali: 39/232 cinghiali, 5/78 caprioli e 2/83 cervi nobili. Il confronto fra le cariche virali negli organi ha rivelato numeri di copie del genoma più alti nel fegato del cinghiale rispetto al muscolo. Tuttavia, dato il basso numero di campioni i analizzati, i risultati mancano di significabilità.

È stato eseguito anche un saggio di RT-PCR nidificato (Nested-PCR) e mirato per il gene RNA-polimerasi RNA-dipendente situato nella ORF-1 del genoma virale. I vari ampliconi hanno mostrato un livello di identità fra il 76 e il 100%.

Un albero filogenetico predisposto per i campioni e dei ceppi di riferimento di sottotipi HEV ha mostrato che la maggior parte delle sequenze si raggruppava in un clade (gruppo monofiletico in un albero genealogico o filogenetico ovvero un sottogruppo monofiletico di un albero filogenetico) contenente i sottotipi 3i e 3c. All’interno di questo clade, le sequenze HEV di cervi e cinghiali di entrambe le stagioni di caccia si sono raggruppate molto strettamente insieme. Anche campioni isolati da pazienti affetti da epatite E umana provenienti dalla Germania si sono raggruppati vicino alle sequenze HEV di cinghiali e cervi. La stessa analisi (Nested RT-PCR) è stata ripetuta relativamente al gene metiltransferasi presente in ORF-1.

Il sequenziamento del prodotto di PCR ha mostrato varie identità nucleotidiche (da 72 a 99%).

I dati raccolti sottolineano l’alta importanza di questa specie animale (cinghiali) nell’epidemiologia dell’HEV e indicano come, probabilmente, i cinghiali rappresentano un serbatoio persistente per questo virus. Inoltre, il rilevamento di elevate quantità di HEV RNA nel fegato di cinghiale, in altri organi e in particolare nei tessuti muscolari evidenzia l’elevato rischio che l’HEV possa essere trasmesso agli esseri umani attraverso il consumo di carne di questi animali che non è stata cotta correttamente.

Al contrario, solo basse percentuali di campioni di capriolo e cervo sono risultati positivi per HEV nello studio.

I dati sull’infezione da HEV nei ruminanti selvatici in Europa sono rari, ma alcuni rapporti hanno dimostrato l’infezione da HEV in diverse specie di cervi. Ad esempio, Neumann et al. hanno riportato prove sierologiche e molecolari di infezione da HEV delle specie di cervi indigene in Germania. Inoltre, è stato rilevato HEV RNA nel fegato, in diversi organi e nel tessuto muscolare delle specie di cervi infette e l’analisi della sequenza ha mostrato una relazione fra HEV di cervo e casi di epatite E umana in Germania. Perciò, nel loro insieme, è probabile che i cervi rappresentino una fonte di HEV per l’uomo e il consumo di carne di cervo poco cotta dovrebbe essere considerato un rischio per contrarre l’infezione da HEV. Tuttavia, la prevalenza di RNA e anticorpi HEV costantemente più bassi nei cervi rispetto ai cinghiali indica una circolazione primaria nei cinghiali e solo la trasmissione accidentale ai cervi. L’ipotesi di infezione da spillover dei cervi è ulteriormente supportata dalle consistenti cariche virali inferiori nei tessuti dei cervi infetti. È stato poi scoperto, tramite l’analisi delle sequenze di HEV, che gli stessi ceppi circolavano nelle specie di cinghiali e cervi analizzati. Questa scoperta si oppone a specifici ceppi di HEV circolanti esclusivamente nelle specie di cervi.

Conclusioni

In futuro, interi genomi virali dovrebbero essere analizzati e dovrebbero essere studiate più aree geografiche anche con analisi parallele di diverse specie di animali, per svelare l’epidemiologia e le dinamiche di trasmissione dell’HEV nella fauna selvatica.

Si ringrazia The Medical Alphabet per il gentile contributo