TPHA e VDRL: test sierologici per la diagnosi della Sifilide

Principio del TPHA e VDRL

Il TPHA (Treponema pallidum Haemoagglutination Assay) ed il VDRL (Veneral Disease Research Laboratory) sono due test microbiologici svolti su siero estremamente importanti nel riscontrare il Treponema pallidum, batterio gram negativo agente eziologico della Sifilide, terza tra le IST (infezioni sessualmente trasmesse) più diffuse al mondo.

Il TPHA è un test di tipo treponemico e si basa sul principio dell’emoagglutinazione passiva, mentre il VDRL è un test non treponemico che rientra tra i test di flocculazione. I test treponemici sono più attendibili poiché rivelano la presenza di anticorpi diretti contro gli antigeni specifici del microrganismo, mentre i test non treponemici rivelano la presenza di anticorpi diretti contro determinate sostanze lipidiche prodotte dal batterio: in caso del VDRL tale sostanza è la cardiopilina, ossia il difosfatidil–glicerolo. I test non treponemici, ovviamente, possono dare falsi positivi e devono sempre essere svolti in concomitanza con i test treponemici quale il TPHA; infatti, l’esecuzione del test non treponemico seguito dal treponemico rientra tra il gold standard per la diagnosi della Sifilide.

Generalmente, i kit utilizzati per il TPHA prevedono l’utilizzo di eritrociti aviari rivestiti dall’antigene del T. pallidum che andranno a legarsi ad un anticorpo specifico presente nel siero del paziente in esame; i kit per il VDRL prevedono invece l’utilizzo di antigeni non treponemici, in grado di rilevare anticorpi non treponema-specifici associati (reaginici).

Metodo

VDRL test: test non treponemico

Il test si svolge su un supporto, chiamato VDRL Carbon Antigen Suspension su cui avverrà la reazione di flocculazione. Su questo supporto sono presenti dei cerchi di reazione in cui andremo a dispensare 50 µl di siero del paziente; successivamente, nella stessa area, si distribuisce una goccia di sospensione dell’antigene e con dei mixing sticks si miscela assieme al siero precedentemente dispensato. Dopo aver svolto anche il controllo negativo e positivo, si pone il supporto su un agitatore automatico per 8 minuti.

Figura 1 - Kit utilizzato per l'esecuzione del VDRL — *Figura 1 – Kit utilizzato per l’esecuzione dell’analisi VDRL*

TPHA test: test treponemico

Il TPHA a differenza del VDRL è più specifico, richiede uno svolgimento diverso e soprattutto una tempistica più lunga per la lettura dei risultati, generalmente intorno alle due ore. Viene svolto su una piastra per microtitolazioni provvista di determinati pozzetti in cui andremo a dispensare, per diluizione, la soluzione tampone (diluente), il siero del paziente, le emazie sensibilizzate con l’antigene e non sensibilizzate (controllo interno negativo).

Si utilizzano, sulla piastra, quattro pozzetti per campione:

Nel primo pozzetto si distribuiscono 100 µl di diluente;
Nel secondo, nel terzo e nel quarto si dispensano 25 µl di diluente;
Il terzo ed il quarto pozzetto sono riservati alle emazie rispettivamente sensibilizzate e non (quest’ultime agiscono come controllo interno negativo della reazione di emoagglutinazione);
Successivamente si distribuiranno 25 µl di siero del paziente in ogni pozzetto e verranno trasferiti 25 µl al successivo; nell’ultimo pozzetto i 25 µl in più verranno scartati.

Dopo aver terminato tutti i campioni, la piastra verrà coperta e lasciata per due ore.

Figura 2 - TPHA test e relativa piastra utilizzata per le microtitolazioni — *Figura 2 – TPHA test e relativa piastra utilizzata per le microtitolazioni*

Risultati attesi

VDRL

In caso di positività avremo sul supporto utilizzato, la presenza di grossi aggregati neri al centro o alla periferia dei cerchi di reazione. L’assenza di tali aggregati, è indicativa di negatività.

TPHA

Se avviene l’agglutinazione gli eritrociti formeranno uno strato omogeneamente diffuso sul fondo del pozzetto. In assenza di agglutinazione gli eritrociti sedimentano, formando un vero e proprio “bottone” compatto al centro del pozzetto.

L’agglutinazione degli eritrociti sensibilizzati e la contemporanea assenza di agglutinazione degli eritrociti di controllo è indice della presenza dell’anticorpo specifico anti-T. pallidum.

Figura 4 - Positività e negatività del TPHA — *Figura 4 – Positività e negatività del TPHA*

Limitazioni del test

Per quanto concerne il VDRL, le limitazioni riguardano la possibilità di avere risultati falsamente positivi anche in caso di altre patologie, quali la mononucleosi infettiva, la polmonite virale o il lupus eritematoso sistemico, non essendo specifico. Per il TPHA non ci sono particolari limitazioni, ma spesso può essere richiesto un ulteriore test di conferma come il FTA-ABS (Fluorescent-Treponemal-Antibody Absorption test) che evidenzia la presenza di anticorpi treponemici mediante l’utilizzo di anticorpi fluorescenti anti immunoglobuline umane.

Quality control

I controlli di qualità, in entrambi i test, vengono svolti simultaneamente. Nel caso del VDRL, assieme ai campioni, verranno dispensate una goccia di controllo positivo ed una goccia di controllo negativo, a cui verrà aggiunta la sospensione antigenica. Nel caso del TPHA il controllo interno negativo è dato dalle emazie non sensibilizzate che in assenza di agglutinazione tenderanno a sedimentare.

Priscilla Caputi