Colorazione di Schaeffer-Fulton: osservazione delle endospore

Obiettivo della tecnica

La colorazione di di Schaeffer-Fulton viene utilizzata in microscopia ottica per l’osservazione della presenza di endospore batteriche.

Le endospore sono strutture intracellulari molto resistenti; vengono prodotte da molti batteri (bacilli Gram positivi, Streptomiceti e Clostridi) per garantirsi la sopravvivenza sia in presenza di condizioni ambientali estreme (quali le alte temperature) che sfavorevoli (scarsità o carenza di nutrienti).

Sono composte da più strati di molecole di natura glicolipida o glicopeptidica e sono strutture fortemente disidratate; per la loro osservazione al microscopio ottico non è pertanto possibile utilizzare gli usuali coloranti ionici idrofilici, ai quali sono resistenti, ma devono essere utilizzate tecniche specifiche, quali la colorazione di Schaeffer-Fulton.

La morfologia e la disposizione delle endospore variano con la specie e sono spesso quindi elementi molto importanti per l’identificazione corretta dei batteri.

Che cos’è e come funziona

La colorazione di Schaeffer-Fulton è stata messa a punto nel 1933 dai due ricercatori di cui porta il nome, Alice B. Schaeffer e MacDonald Fulton del Middlebury College, i quali a loro volta perfezionarono una tecnica in realtà già nota e risalente al 1922.

E’ una colorazione cosiddetta: ”differenziale o di contrasto”, permette infatti di distinguere tra due differenti strutture di uno stesso microrganismo attraverso l’utilizzo di due coloranti, nei confronti dei quali tali strutture reagiscono diversamente: il colorante primario o principale è il verde malachite (che colora specificatamente le endospore ma non le cellule madri), mentre il colorante di contrasto è la safranina (che colora invece soltanto le cellule madri).

La penetrazione del colorante principale nelle endospore, in questa tecnica, è facilitata esponendo il campione ad un intenso calore per un certo periodo di tempo dopo il trattamento col verde malachite; successivamente si applica la safranina.

Al termine, le endospore presenti risulteranno colorate di verde, mentre le cellule madri batteriche appariranno colorate, sullo sfondo, di un’accesa tonalità tra il rosso ed il fucsia.

Materiale occorrente

un vetrino per microscopio;
una spruzzetta contenete acqua distillata;
verde malachite (soluzione acquosa al 5%);
safranina (soluzione al 2,5%);
un becher di medie dimensioni contenente acqua distillata.

Procedimento

Preliminarmente, si porrà il becher con l’acqua a bollire; appena viene raggiunta la temperatura d’ebollizione, si proceda come segue:

depositare il campione da analizzare su un vetrino per microscopia ed effettuarne la fissazione al calore, quindi lasciar raffreddare;
tramite un contagocce, disporre il verde malachite sul vetrino;
appoggiare il vetrino sopra al becher contenente l’acqua in ebollizione, in modo che sia esposto al vapore bollente e mantenerlo in tale posizione per circa 3-5 minuti (è importante, durante questa fase, evitare che il vetrino vada a secco: per evitare che ciò avvenga, se necessario aggiungere qualche altra goccia di verde malachite durante l’esposizione);
allontanare il vetrino e lasciarlo raffreddare: solo quando esso non scotterà più, effettuare un lavaggio con acqua distillata del colorante primario in eccesso;
asciugare il vetrino, poi applicare con un contagocce la safranina di contrasto e lasciar agire per circa 2 minuti;
effettuare un lavaggio con acqua distillata per allontanare il colorante di contrasto in eccesso, quindi asciugare.

Il vetrino cosi’ preparato (Fig.1) è ora pronto per l’osservazione al microscopio ottico.

Figura 1 – uno specchietto riassuntivo della procedura di preparazione del campione

Osservazione del vetrino

L’osservazione viene condotta al normale microscopio ottico, con un livello d’ingrandimento già discreto ricorrendo al 10X (Fig.2).

Figura 2 – dimensioni delle cellule microbiche e possibile aspetto finale del vetrino

Le cellule batteriche contenente le endospore appariranno colorate di un’accesa tonalità tra il rosso ed il fucsia; la spora all’interno, di forma ellittica o sferica, risulterà invece colorata in verde.

Eventuali batteri non sporigeni presenti saranno anch’essi rosso fucsia (essendo comunque permeabili alla safranina) ma non presenteranno ovviamente alcuna endospora (Fig.3).

Figura 3 – i batteri all’interno del cerchio evidenziato si sono colorati in seguito ad esposizione con la safranina ma non presentano al loro interno alcuna spora riconoscibile, come invece accade per gli altri: è pertanto probabile che in questo campione siano presenti anche batteri non sporigeni, sebbene sarebbe necessario eseguire ulteriori test più selettivi per verificarlo