Test di solubilità biliare

Principio

Il test di solubilità biliare viene utilizzato per distinguere Streptococcus pneumoniae da tutti gli altri streptococchi alfa-emolitici. Il principio si basa sull’azione litica del desossicolato di sodio per la parete pneumococcica. Streptococcus pneumoniae è sensibile alla bile mentre tutti gli altri streptococchi alfa-emolitici sono resistenti ad essa.

Metodo

Per eseguire il test di solubilità biliare è necessario preparare la soluzione di sodio desossicolato (sale bile) al 2% bisogna sciogliere 2 g di desossicolato di sodio in 100 ml di acqua distillata sterile.

Metodo in provetta

Preparare una sospensione di una coltura pura in 2 ml di soluzione fisiologica allo 0,85%;
Dividere la soluzione ottenuta con la sospensione batterica in due provette separate;
Regolare la torbidità su quella dello standard 0,5-1 McFarland;
In una provetta aggiungere 2 gocce di desossicolato di sodio al 2% e mescolare; nell’altra provetta (provetta di controllo) aggiungere 2 gocce di acqua distillata con acqua sterile e mescolare;
Lasciare incubare entrambe le provette per 10-15 minuti a 35-37 °C;
Osservare una dissoluzione della torbidità nella provetta contenente il 2% di desossilato di sodio. Se la torbidità persiste, continuare l’incubazione fino a 3 ore;
Osservare di nuovo l’eventuale dissoluzione della torbidità.

Metodo in piastra

Incubare il campione su agar sangue per 12-24 ore;
Posizionare una o due gocce di sodio desossicolato al 10% su una colonia isolata (18-24 ore) in agar sangue;
Incubare la piastra di coltura a 35-37 °C per 30 minuti;
Esaminare l’eventuale lisi della colonia.

Figura 1 – Metodo con provette: A sinistra lo *S. mitis* non lisato dalla presenza della bile, a destra *S. pneumoniae* lisato dalla presenza biliare.

Figura 2 – Metodo in piastra: la freccia A evidenzia la colonia lisata (test positivo), la freccia B evidenzia la colonia intatta (test negativo).

Risultati attesi

Positivo: nel metodo in provetta il terreno si chiarifica per la solubilizzazione biliare, presenza di S. pneumoniae; nel metodo in piastra si osserverà la lisi della colonia di Streptococcus pneumoniae;
Negativo: nel metodo in provetta il terreno risulta torbido per la mancanza della solubilizzazione biliare, assenza di S. pneumoniae; nel metodo in piastra si osserverà l’integrità della colonia batterica.

Limitazioni del test

Alcuni microrganismi non si lisano in presenza di bile, probabilmente a causa della perdita del fattore di virulenza o della capsula. Pertanto, le colonie che morfologicamente somigliano a S. pneumoniae che non sono solubili nella bile dovrebbero essere ulteriormente identificate usando un altro metodo, come la suscettibilità all’optochina;
La diminuzione parziale della torbidità non è considerata come elemento positivo per l’identificazione pneumococcica;
La normale autolisi dello S. pneumoniae può essere inibita da un’alta concentrazione di sali biliari;
Quando si esegue il test utilizzando un brodo salino o non tamponato, è essenziale regolare il pH su un valore neutro prima di aggiungere il reagente, al fine di evitare reazioni falso-negative.

Quality control

Ogni nuovo lotto di desossicolato di sodio deve essere testato con ceppi di controllo di qualità positivi e negativi. Il ceppo di S. pneumoniae ATCC 49619 può essere utilizzato come controllo positivo e il ceppo di S. mitis ATCC 49456 può essere utilizzato come controllo negativo.